辛曉斐，吳 琰，賀彥娜，丁 黎

中國藥科大學藥物分析教研室，南京210009

人血漿中痕量炔雌醇衍生化LC-MS/MS測定方法的建立及其藥動學研究

辛曉斐，吳 琰，賀彥娜，丁 黎*

中國藥科大學藥物分析教研室，南京210009

目的：建立柱前衍生化測定人血漿中痕量炔雌醇的LC-MS/MS方法，并研究中國健康女性受試者空腹口服左炔諾孕酮炔雌醇片（每片含0.02 mg炔雌醇和0.1 mg左炔諾孕酮）后炔雌醇的藥動學特征。方法：血漿樣品經(jīng)過環(huán)己烷-乙醚（7∶1）提取吹干后，殘渣溶解于pH 10.5的碳酸氫鈉溶液中，并用丹酰氯丙酮溶液在60℃反應6 min后進行LC-MS/MS分析。以Hedera ODS-2（2.1 mm×150 mm，5 μm）為分析柱，流動相為含0.1%甲酸的水溶液-甲醇（13∶87），梯度洗脫。炔雌醇丹酰氯衍生物和內(nèi)標米非司酮的檢測離子分別為m/z 530.2→171.1和m/z 430.1→372.2，對中國健康女性受試者空腹口服左炔諾孕酮炔雌醇片后，血漿中炔雌醇的濃度進行測定，并計算主要藥代動力學參數(shù)。結(jié)果與結(jié)論：炔雌醇的血藥濃度在1.059~211.7 pg·mL-1范圍內(nèi)線性良好，中國健康女性受試者單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的cmax分別為（58.1±25.1）pg·mL-1和（76.5±19.7）pg·mL-1，tmax分別為（1.8±0.6）h和（1.9±0.9）h，AUC分別為（611±223）pg·h·mL-1和（762±189）pg·h·mL-1，t1/2分別為（12.36±4.42）h和（15.44±3.81）h。以上炔雌醇的藥動學特征為首次報道。

柱前衍生化；炔雌醇；丹酰氯；LC-MS/MS；藥代動力學

左炔諾孕酮炔雌醇片的炔雌醇和左炔諾孕酮為避孕藥的常用成分，能通過抑制卵巢活性達到避孕目的。國外文獻報道，該制劑連續(xù)服藥后炔雌醇的人體穩(wěn)態(tài)血藥濃度為（77±30）pg·mL-1，穩(wěn)態(tài)時最低血藥濃度為（10.5±5.1）pg·mL-1[1]，因此，為研究該制劑在中國健康女性受試者體內(nèi)的藥動學特征，需建立高靈敏度的方法對血漿中痕量的炔雌醇進行測定。國內(nèi)外建立了測定炔雌醇的多種方法仍有局限：免疫法[2]專屬性差；GC-MS/MS法[3]樣品前處理繁瑣且分析時間長，不適合高通量樣本分析；HPLC法[4]靈敏度不夠；LC-MS/MS法[5]可在電噴霧離子化（ESI）或大氣壓化學離子化（APCI）負離子條件下測定炔雌醇，但是靈敏度仍無法達到本試驗的測定要求；柱前衍生化[6]測定炔雌醇的樣品處理過程須進一步優(yōu)化，以滿足本試驗的測定要求（定量下限為1 pg·mL-1），且衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性須進一步考察。為此，本文建立了測定人血漿中炔雌醇的LC-MS/MS法，定量下限為1 pg·mL-1，為目前報道的最低值，可用于炔雌醇的藥動學研究。此外，本文首次報道了中國健康女性受試者空腹口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的人體藥動學特征。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng) （美國Agilen公司）；API 4000三重四級桿質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子化接口，Analyst Software 1.5.2數(shù)據(jù)采集軟件（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 藥品和試劑

左炔諾孕酮炔雌醇片 （北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號：43121123，規(guī)格：21片，每片含左炔諾孕酮0.1 mg，炔雌醇0.02 mg）；炔雌醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100052-200609，純度：99.5%）；米非司酮對照品（USP，批號：FDH385）；丹酰氯（日本東京化成工業(yè)株式會社，批號：R6U2NTN，含量98.0%）；甲醇和乙腈（為色譜純，德國Mer-ck公司）；其余試劑均為市售分析純；水為去離子水。

2 方 法

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱：Hanbon Hedera ODS-2（2．1mm×150mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；流動相：甲醇-0．1%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～3．0min，維持87%甲醇；3．0～3．1 min，87%甲醇線性升至100%甲醇；3．1～7．0 min，維持100%甲醇；7．0～7．1min，100%甲醇線性降至87%甲醇；7．1～10．0 min，維持87%甲醇）；流速：0．5 mL· min-1；進樣量：15 μL；進樣器控溫：15℃；柱溫：35℃。

多反應離子監(jiān)測（MRM）；氣動輔助電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；檢測對象：炔雌醇的丹酰氯衍生物，m/z 530．2→171．1；內(nèi)標（米非司酮），m/ z 430．1→372．2；碰撞氣壓力：68．9 kPa；氣簾氣壓力：206．8 kPa；離子源氣體1壓力：413．7 kPa；離子源氣體2壓力：344．7 kPa；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度：500℃。其它參數(shù)見表1。待測物質(zhì)子化分子離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖見圖1。

表1 待測物的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置

圖1 待測物質(zhì)子化分子離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖

2.2 溶液的配制

以甲醇為溶劑，配制1．059 mg·mL-1的炔雌醇儲備液，并以甲醇逐級稀釋，得到濃度分別為105．9、10．59、1．059 μg·mL-1；105．9、10．59、1．059 ng·mL-1；529．3、132．3、52．93 pg·mL-1；6．352、3．176、1．588 ng· mL-1的炔雌醇系列對照品溶液。以甲醇為溶劑，配制1．042mg·mL-1米非司酮的儲備液，并以甲醇逐級稀釋，得到濃度為5．210 μg·mL-1的米非司酮對照品溶液。

配制濃度為1．086 mg·mL-1的丹酰氯丙酮溶液。

配制濃度為100．8 mmol·L-1的碳酸氫鈉水溶液，用氫氧化鈉調(diào)pH至10．5。

2.3 血漿樣品的提取及衍生化處理

于10 mL離心管中精密加入血漿樣品1 mL，加入內(nèi)標溶液（5．210 μg·mL-1）20 μL，旋渦混勻，再加入環(huán)己烷-乙醚（7∶1）4．0 mL，渦旋3 min，于4000 r· min-1離心8 min。取上層有機相3 mL，于37℃水浴以氮氣流吹干。在提取好的血漿殘渣樣品中加入100 mmol·L-1碳酸氫鈉溶液100 μL（pH 10．5），渦旋1 min，再加入1 mg·mL-1的丹酰氯丙酮溶液100 μL，渦旋1 min，60℃水浴加熱6 min。再以15600 r·min-1離心3 min，取上層澄清溶液于自動進樣器樣品瓶中，進樣量15 μL，進行LC-MS/MS分析。

2.4 臨床試驗方案

12名健康女性受試者，年齡26～43歲，身高（163．1±2．4）cm，體重 （60．9±2．3）kg，體重指數(shù)（22．9±0．8）kg·m-2。體格檢查顯示血壓、心肝腎功能和血、尿常規(guī)無異常。受試者于試驗前兩周及試驗期間未服用其他任何藥物。本試驗遵守《赫爾辛基宣言》有關(guān)倫理準則，試驗方案經(jīng)中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥物臨床試驗倫理委員會審議通過，受試者自愿參加試驗并簽署知情同意書。

采用單中心、開放、隨機試驗。選擇符合入選標準的健康成年女性受試者12人進行單次（1片左炔諾孕酮炔雌醇片）及多次給藥試驗。

單次給藥藥動學試驗：12名健康女性受試者，空腹給藥1次（8∶00），在給藥前（0 h）和給藥后10、20、30、45 min，1、1．5、2、2．5、3、4、6、9、14、24、36、48、72 h分別采集靜脈血5 mL于肝素試管中，離心5 min（4000 r·min-1），分離血漿，置-80℃保存待測。

多次給藥藥動學試驗：12名健康女性受試者單次給藥結(jié)束后，立即（單次給藥的第4天為多次給藥第1天）進行多次給藥人體藥代動力學試驗。每天1次（8∶00），每次1片，連續(xù)給藥21 d。多次給藥第21天 （試驗的第24天）受試者禁食12 h后，早晨空腹給藥，給藥后4 h進統(tǒng)一食譜的標準餐。多次給藥第19天、第20天的采血點為受試者的谷濃度點，即19、20 d。達穩(wěn)態(tài)后，多次給藥第21天給藥前（0 h）和給藥后 10、20、30、45 min，1、1．5、2、2．5、3、4、6、9、14、24、36、48、72 h分別采集靜脈血5 mL，離心5min（4000r·min-1），分離血漿，置-80℃保存待測。

用LC-MS/MS法測定血漿中炔雌醇的濃度，采用DAS 2．0軟件計算主要的藥代動力學參數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 特異性考察

炔雌醇和內(nèi)標的保留時間分別為4．28 min和1．74 min，無雜峰干擾測定，色譜圖見圖2。

圖2 炔雌醇色譜圖

3.2 標準曲線制備及定量下限

配制含炔雌醇濃度分別為1．059、3．176、10．59、31．76、63．52、127．0、211．7 pg·mL-1的標準含藥血漿各1 mL，在每支標準含藥血漿離心管中精密加入內(nèi)標溶液（5．210 μg·mL-1）20 μL，旋渦混勻，按“2．3”項下方法操作后進行分析，計算炔雌醇丹酰氯衍生物的峰面積As與內(nèi)標峰面積Ai的比值f（f=As/Ai）。以峰面積比值f分別對炔雌醇的血藥濃度c作權(quán)重回歸計算，得炔雌醇的回歸方程：f=0．00516c+0．00148，r=0．9985，權(quán)重系數(shù)w=1/c2。結(jié)果顯示，炔雌醇的血藥濃度在1．059～211．7 pg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為1．059 pg·mL-1，信噪比為48。

3.3 精密度與準確度試驗

在定量下限，低、中、高質(zhì)控樣品（含炔雌醇濃度分別為1．059、2．647、21．17、169．4 pg·mL-1的標準含藥血漿）4個濃度水平，采用3個分析批，每批每個濃度5份樣品，對該方法進行準確度與批內(nèi)和批間精密度考察，結(jié)果見表2。炔雌醇的準確度與批內(nèi)和批間精密度符合生物樣品分析要求。

3.4 提取回收率與基質(zhì)效應

按文獻報道的方法[7]，配制并處理炔雌醇濃度分別為2．647、21．17、169．4 pg·mL-1的標準含藥血漿，考察提取回收率和基質(zhì)效應（ME）。測定得血漿中內(nèi)標的回收率為 （88．2±1．8）%，ME為 （97．3± 2．6）%，血漿中炔雌醇和內(nèi)標的回收率及ME見表2。結(jié)果表明，本實驗條件下炔雌醇和內(nèi)標的回收率均良好，血漿基質(zhì)對其離子化及測定無影響。

表2 血漿中炔雌醇LC-MS/MS測定方法的精密度、準確度、回收率和基質(zhì)效應（±s，n=5）

表2 血漿中炔雌醇LC-MS/MS測定方法的精密度、準確度、回收率和基質(zhì)效應（±s，n=5）

質(zhì)量濃度/ pg·mL-1RSD/%批內(nèi)批間準確度/ %提取回收率/ %基質(zhì)效應/ % 1．059 9．6 10．1 98．6±10．8 --2．647 8．3 5．0 107．5±3．0 72．0±6．0 100．4±3．1 21．17 4．5 4．1 96．7±3．1 70．4±3．9 95．8±1．2 169．4 3．5 7．1 91．8±2．4 69．3±2．7 97．2±4．6

3.5 穩(wěn)定性考察

配制炔雌醇濃度分別為2．647、169．4 pg·mL-1的標準含藥血漿若干份，其中3份按“2．3”項下方法處理后，立即測定；另取3份室溫放置8 h、3份反復凍融3次及-20℃冰凍放置78d，考察血漿樣品穩(wěn)定性；同時考察血漿樣品提取后的殘渣于室溫放置6 h及-20℃冰凍放置75 h，血漿樣品提取并衍生化后的炔雌醇丹酰氯衍生物于進樣器15℃放置18 h及室溫放置8 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，炔雌醇各考察項穩(wěn)定性良好，炔雌醇丹酰氯衍生物室溫放置8h穩(wěn)定。

本實驗考察了不同pH衍生化條件下，炔雌醇丹酰氯衍生物的室溫放置穩(wěn)定性，結(jié)果表明不同pH衍生化條件下，炔雌醇丹酰氯衍生物在室溫中均有不同程度的降解，pH為10．5時炔雌醇丹酰氯衍生物最穩(wěn)定，為最適衍生化pH值。

3.6 藥動學研究

12名中國健康女性受試者單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片 （每片含0．02 mg炔雌醇和0．1 mg左炔諾孕酮）后炔雌醇的平均血藥濃度-時間曲線見圖3。本文首次報道了中國健康女性受試者在單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的藥動學參數(shù)，cmax、tmax和AUC的結(jié)果見表3；t1/2分別為 （12．36±4．42）h和 （15．44±3．81）h，MRT0-72分別為（12．2±3．2）h和（17．3±3．2）h，Cl/F分別為（37．67±16．17）L·h-1和（23．15±14．37）L·h-1，Vd/ F分別為（609．6±174．8）L和（408．7±94．2）L。將第19天、第20天和第21天的三組谷濃度點進行單因素方差分析，結(jié)果表明在給藥第21天時炔雌醇已達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。將本研究獲得的炔雌醇的主要藥動學參數(shù)與國外已上市同品種、同劑量的左炔諾孕酮炔雌醇片Alesse誖和Levlite誖的主要藥動學參數(shù)進行比較（見表3），結(jié)果表明中國女性受試者口服左炔諾孕酮炔雌醇片后，體內(nèi)炔雌醇的藥動學參數(shù)與國外女性受試者基本一致。

4 討 論

血漿樣品中炔雌醇經(jīng)過提取后的殘渣在堿性條件下進行衍生化后形成磺酰酯結(jié)構(gòu)，經(jīng)過衍生化時間和溫度的考察，結(jié)果表明，炔雌醇與丹酰氯丙酮溶液在60℃反應6min時產(chǎn)率最高。但是磺酰酯結(jié)構(gòu)在堿性條件下會發(fā)生水解，因此本實驗考察了文獻報道的不同pH衍生化條件下炔雌醇丹酰氯衍生物室溫放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，炔雌醇丹酰氯衍生物在室溫中均有不同程度的降解，且pH為10．5時炔雌醇丹酰氯衍生物最穩(wěn)定，為最適宜衍生化pH值。

圖3 12名中國健康女性受試者單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的平均血藥濃度-時間曲線

表3 本研究與Alesse誖、Levlite誖的炔雌醇主要藥動學參數(shù)比較

[1]FDA,Available at:www．a(chǎn) ccessdata．fda．gov/drugsatf-da_docs/label/2008/020683s004s006s007lbl．pdf

[2]Back D,Breckenridge A,Crawford FE,et al．An in-vestigation of the pharmacokinetics of ethynylestsadiol in women using badioimmunoassay[J]．Contraception, 1979,20(3):263-73．

[3]Stanczyk FZ,Clarke NJ．Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones[J]．J Steroid Biochem,2010,121(3-5):491-5．

[4]Lima DLD,Silva CP,Otero M,et al．Low cost method-ology for estrogens monitoring in water samples using dispersive liquid-liquid microextraction and HPLC with fluorescence detection[J]．Talanta,2013,115(1):980-5．

[5]Twaddle NC,Churchwell MI,Newbold RR,et al．De-termination using liquid-chromatography-electrospray tandem mass spectroscopy ofethinylestradiolserum pharmacokinetics in adult Sprague-Dawley rats[J]．J Chromatogr B,2003,793(2):309-15．

[6]劉笑芬，丁存剛，葛慶華，等．柱前衍生，LC-MS/MS同時測定血漿中的孕二烯酮，依托孕烯和炔雌醇[J]．藥學學報，2010，45（1）：87-92．

[7]劉荷英，儲 妍，于 勇，等．LC-MS/MS法同時測定人尿液中5-氟尿嘧啶和吉美嘧啶濃度及其尿藥排泄研究[J]．藥學與臨床研究，2010，18（3）：256-9．

A Sensitive Derivatization Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry Method for the Determination of the Trace Amount of Ethinyl Estradiol in Human Plasma:Method Development and Its Application in a Pharmacokinetic Study

XIN Xiao-fei,WU Yan,HE Yan-na,DING Li*
Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:An pre-column derivatization liquid chromatography-tandem mass spectrometry method (LC-MS/MS)for the determination of trace amount of ethinyl estradiol (EE)in human plasma was developed．The method was validated and applied to a pharmacokinetics study in healthy Chinese female volunteers after oral administration of the combination tablets containing 0．02 mg EE and 0．1 mg lev-onorgestrel (LNG)．Methods:The plasma sample was extracted with a mixture of cyclohexane and diethyl ether(7∶1,v/v)．The extract was dried and derived with dansyl chloride at 60℃for 6 min in a buffer solution of pH 10．5,and then analyzed by the developed LC-MS/MS method．Chromatographic separation was per-formed on an Hedera ODS-2 (150 mm×2．1 mm,5 μm)column with a gradient elution system of water con-taining 0．1%acetic acid-methanol(13∶87)．An electrospray ionization source was applied and performed in positive ion mode．The ion transitions recorded in multiple reaction monitoring mode were m/z 530．2→171．1 for derived EE and m/z 430．1→372．2 for internal standard,respectively．Results and Conclusion:The calibration curves were linear over the concentration range of 1．059～211．7 pg·mL-1．After single and multiple doses,cmaxof EE were(58．1±25．1)and(76．5±19．7)pg·mL-1,tmaxof EE were(1．8±0．6)and(1．9±0．9)h,AUC of EE were(611±223)and(762±189)pg·h·mL-1,t1/2of EE were(12．36±4．42)and(15．44±3．81)h,respec-tively．The pharmacokinetic characteristics of EE in Chinese female were reported for the first time．

Pre-column derivatization;Ethinyl estradiol;Dansyl chloride;LC-MS/MS;Pharmacokinetics

R969.1

A

1673-7806（2015）03-259-04

辛曉斐，女，碩士生 E-mail:xxf492070131@126.com

*通訊作者丁黎，男，博士生導師，教授 E-mail:dinglidl@sina.com

2015-01-12

2015-01-30