李榮良，韓扣蘭，戴小麗，黃 誠，李衛(wèi)勇

（鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鹽城224005）

毒性彌漫性甲狀腺腫（Grave′s disease，GD）是以甲狀腺的自身免疫為特點的多系統(tǒng)臨床綜合征，是甲亢的主要類型之一。GD 患者體內(nèi)存在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)受損，以致免疫應(yīng)答反應(yīng)過強而造成甲狀腺細胞的自身免疫性損傷。臍帶間質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是一種具有向多向分化潛能的祖細胞，在體外能大量擴增，能著巢于受損組織。MSCs通過對T 細胞、B 細胞和樹突狀細胞（DC）等免疫活性細胞的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用［1］。MSCs免疫原性較低，在異基因MSCs移植時未發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)。MSCs在分化成其他細胞類型時仍保留其免疫調(diào)節(jié)作用［2］。目前，在臨床上，MSCs已被廣泛用于治療移植物抗宿主?。℅VHD）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等自身性免疫?。?］。Choi等［4］最近研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源的MSCs可以影響T 輔助（Th）細胞因子的平衡治療甲狀腺炎。作者先前研究表明，UC-MSCs治療GD 小鼠安全有效［5］。本實驗將通過比較UC-MSCs治療GD 小鼠前、后脾臟Bregs表達量與對照小鼠有無差異，以及其與甲狀腺刺激抗體（TSAb）水平是否存在相關(guān)性來初步探討MSCs治療GD 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因擴增引物設(shè)計及合成 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站GenBank 查詢鼠甘油醛-3-磷酸脫氧酶（GAPDH）（上游引物：5′-AAG CCT GAC CAC GCT TTC TA-3′，下 游 引 物：5′-ATG AAG TGG TTG GGG AAT GA-3′）、白細胞介素-10（IL-10）（上游引物：5′-CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA-3′，下游引物：5′-TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG-3′）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）（上游引物：5′-TGC GCT TGC AGA GAT TAA AA-3′，下游引物：5′-CGT CAA AAG ACA GCC ACT CA-3′）mRNA 序列。以上引物的設(shè)計與合成由大連TaKaRa 公司利用Primer express 軟件完成。

1.1.2 試劑與動物 36只6～8周齡雌性BALB／c小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），體質(zhì)量（20.0±2.0）g。臍帶標本來源于健康產(chǎn)婦正常分娩足月新生兒（來自于鹽城市婦幼保健院產(chǎn)科），UC-MSCs分離、培養(yǎng)與鑒定所需的試劑同前期研究［6］。血清游離甲狀腺素（FT4）檢測試劑盒與TSAb檢測酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒分別由美國DPC 與天津瑞愛金生物科技有限公司提供；PE-CD1d、FITC-CD5、PerCP-cyTM5.5-CD19共3種不同熒光標記抗鼠單克隆抗體均購自美國BD 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒均來源于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 GD 模型小鼠的制備與分組 GD 模型小鼠（在江蘇省醫(yī)藥動物實驗中心SPF 級環(huán)境下飼養(yǎng)）的免疫方法與步驟同本課題組之前的研究［5］，在第3次免疫后21d（18周）測定移植前血清中FT4與TSAb的表達量，細針穿刺甲狀腺組織蘇木精-伊紅（HE）切片染色。第19周分別隨機選擇3只GD 模型小鼠與1只正常對照小鼠處死，將剩余小鼠分成3組，即正常對照組（G0組，8只）、GD 對 照 組（G1 組，12 只）、UC-MSCs治療組（G2組，12只）。第20周G1組與G2組分別于予0.5 mL生理鹽水和l×106P3代UC-MSCs尾靜脈注射1次，第26周處死所有小鼠，檢測實驗預(yù)先設(shè)計內(nèi)容。

1.2.2 UC-MSCs收集和單個核細胞分離及培養(yǎng)、鑒定 同本課題組之前的研究方法［5］，將臍帶從手術(shù)臺上取下，將臍帶剪碎后用胰酶消化成單個細胞，培養(yǎng)與傳代至細胞融合，最后應(yīng)用FACScan流式細胞儀檢測MSCs表面標志。

1.2.3 血清TSAb、FT4的測定 ELISA 法測定血清TSAb的濃度，F(xiàn)T4測定按試劑盒說明書操作。

1.2.4 組織鑒定 將甲狀腺固定、包埋、切片與HE 染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)等組織學(xué)變化。

1.2.5 調(diào)節(jié)性B細胞（Bregs）的檢測 在小鼠脾臟單個核細胞懸液（1.0×106／mL）加入脂多糖（LPS）10μg／mL，在標準條件下培養(yǎng)24h后，加入PE-CD1d、FITC-CD5、PerCP-cyTM5.5-CD19共3種不同熒光標記抗鼠單克隆抗體，并做熒光染色對照，前向散射光（FSC）與側(cè)向散射光（SSC）聯(lián)合設(shè)門流式檢測小鼠脾臟CD1dhiCD5＋CD19＋細胞的表達量（圖1）。

圖1 流式細胞術(shù)檢測CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs代表圖

1.2.6 實時熒光定量PCR 分析 應(yīng)用TRIzol-氯仿法試劑裂解、純化抽提脾細胞總RNA，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA），再在ABI Prism7500型高通量熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）上進行實時熒光定量PCR。按2步法PCR 擴增標準程序?qū)⒉煌虻臉吮咀?個復(fù)孔。擴增條件為第1步（預(yù)變性），95 ℃10s1個循環(huán)；第2步（PCR 反應(yīng)）95 ℃5s、60 ℃34s45個循環(huán)。最后以SDS2.0（PE Biosystem）軟件分析其Ct值。計算各標本平均Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參，將IL-10、TGF-βCt值減去GAPDH Ct值作為△Ct值。計算標準化后的2-ΔΔCt值表示mRNA 的相對表達含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，對各分組進行單因數(shù)方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UC-MSCs移植對GD 小鼠血清FT4及TSAb的影響 移植后，G1組血清FT4與TSAb水平均顯著高于G0組（P＜0.05）；G2組FT4與TSAb表達低于G1組，但FT4無顯著差異，而TSAb差異明顯（P＜0.05），見表1。

表1 移植后血清FT4、TSAb水平與脾臟CD19＋B細胞、CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs百分比（±s）

表1 移植后血清FT4、TSAb水平與脾臟CD19＋B細胞、CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs百分比（±s）

＊：P＜0.05，與G0組比較；△：P＜0.05，G0組比較。

組別 n FT4（pmol／L） TSAb（U／mL） CD19＋B細胞（%） CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs（%）G0組8 4.98±0.20 2.90±0.37 7.81±0.89 6.21±0.43 G1組 12 12.07±1.11＊ 5.73±0.65＊ 11.00±1.41＊ 4.16±0.67＊G2組 12 11.60±1.19 3.09±0.31△ 8.05±0.84△ 6.76±0.88△

圖2 UC-MSCs移植后脾臟IL-10與TGF-β mRNA 的表達水平

2.2 UC-MSCs移植對GD模型鼠脾臟CD19＋B細胞與CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs表達影響移植后，G1組血清CD19＋B細胞百分比均顯著高于G0組（P＜0.05），而CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs百分比卻顯著低于G0組（P＜0.05）；G2組CD19＋B細胞百分比明顯低于G1 組（P＜0.05），但CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs百分比明顯高于G1組（P＜0.05）。

2.3 UC-MSCs移植對GD 模型鼠脾臟組織IL-10與TGF-β mRNA 表達的影響 移植后，G1組脾臟IL-10與TGF-βmRNA 水平均顯著低于G0組與G2組（P＜0.05），見圖2。

2.4 TSAb與CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs在移植前、后表達水平變化的相關(guān)性 G2組GD 小鼠血清TSAb濃度差（治療前-治療后）與CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs水平變化（治療前-治療后）呈顯著負相關(guān)（r＝-0.943，P＜0.01），與IL-10與TGFβmRNA 表達水平的△△Ct值（治療前-治療后）呈顯著正相關(guān)（r＝0.800、0.768，P＜0.01），見圖3。

圖3 UC-MSCs移植前、后TSAb與CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs表達的相關(guān)性

3 討 論

促甲狀腺素受體抗體（TRAb）是由B 淋巴細胞產(chǎn)生的一類具有異質(zhì)性的特異性免疫球蛋白（IgG 類），其中，TSAb能夠與促甲狀腺激素受體結(jié)合，刺激甲狀腺激素的合成和分泌，從而引起甲狀腺功能亢進的表現(xiàn)。Bregs是新發(fā)現(xiàn)的B 細胞亞群之一，CD1dhiCD5＋CD19＋是目前國際上比較公認的Bregs表型［6］。研究發(fā)現(xiàn)，Bregs在炎性腸病、1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用［7-11］。UC-MSCs移植治療GD 小鼠時發(fā)現(xiàn)，G2組GD 小鼠血清TSAb的水平較對照組明顯下降，同時脾臟CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs的水平較對照組卻明顯上升，且二者的變化存在明顯相關(guān)性。這說明UC-MSCs移植治療GD 小鼠可能是通過上調(diào)CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs而發(fā)揮治療作用。

在輔助性T 細胞誘導(dǎo)下GD 患者體內(nèi)被激活的B細胞分泌大量的自身抗體，CD19 與B 細胞活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)［12］。有 研 究 表 明，IL-10、TGF-β是2 種 重 要 的 抑 制 性 細 胞因子，Bregs可通過其分泌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［13］。通常把產(chǎn)生IL-10的具有CD1dhiCD5＋CD19＋表型的Bregs亞群稱之為B10細胞，它們能特異地產(chǎn)生IL-10 并且是其主要B 細胞來源，而且它們可能只產(chǎn)生IL-10［14］。Hussain等［8］研究發(fā)現(xiàn)，給1型糖尿病的NOD 模型小鼠靜脈輸注經(jīng)B 細胞抗原受體（BCR）激活的B細胞，可以通過其產(chǎn)生的IL-10使NOD 小鼠的胰島炎性指標表達下降，延緩糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。還有一種在體外可以被LPS 刺激活化而分泌TGF-β 的Bregs 細胞［15］。同樣，在給患有結(jié)腸炎的SAMP1／Yit小鼠體內(nèi)靜脈輸注經(jīng)過LPS 刺激CD1d＋的B 細胞亞群，可以通過它產(chǎn)生TGF-β抑制免疫反應(yīng)，減少炎性損傷［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，GD 小鼠脾臟IL-10mRNA 與TGF-βmRNA表達量較正常對照小鼠明顯降低，但經(jīng)過UC-MSCs移植治療后其表達卻明顯上升。

綜上所述，Bregs異常表達不僅與GD 發(fā)病密切相關(guān)，而且UC-MSCs可通過上調(diào)Bregs而產(chǎn)生IL-10、TGF-β，在治療GD中介導(dǎo)免疫耐受，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

［1］ Aggarwal S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses［J］.Blood，2005，105（4）：1815-1822.

［2］ Le Blanc K，Rasmusson I，Sundberg B，et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells［J］.Lancet，2004，363（9419）：1439-1441.

［3］ 張華勇，馮學(xué)兵，馬曉蕾，等.異基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡11例臨床分析［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2009，13（2）：89-92.

［4］ Choi EW，Shin IS，Lee HW，et al.Transplantation of CTLA4Ig gene-transduced adipose tissue-derived mesenchymal stem cells reduces inflammatory immune response and improves Th1／Th2balance in experimental autoimmune thyroiditis［J］.J Gene Med，2011，13（1）：3-16.

［5］ 李榮良，韓扣蘭，戴小麗，等.人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療Graves病小鼠的療效［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（36）：17-20.

［6］ Yanaba K，Bouaziz JD，Haas KM，et al.A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5＋phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses［J］.Immunity，2008，28（5）：639-650.

［7］ Matsushita T，Yanaba K，Bouaziz JD，et al.Regulatory B cells inhibit EAE initiation in mice while other B cells promote disease progression［J］.J Clin Invest，2008，118（10）：3420-3430.

［8］ Hussain S，Delovitch TL.Intravenous transfusion of BCRactivated B cells protects NOD mice from type 1diabetes in an IL-10-dependent manner［J］.Immunol，2007，179（11）：7225-7232.

［9］ Lenert P，Brummel R，F(xiàn)ield EH，et al.TLR-9activation of marginal zone B cells in lupus mice regulates immunity through increased IL-10production［J］.J Clin Immunol，2005，25（1）：29-40.

［10］ Yanaba K，Hamaguchi Y，Venturi GM，et al.B cell depletion delays collagen-induced arthritis in mice：arthritis induction requires synergy between humoral and cell-mediated immunity［J］.J Immunol，2007，179（2）：1369-1380.

［11］ Mizoguchi A，Bhan AK.A case for regulatory B cells［J］.J Immunol，2006，176（2）：705-710.

［12］ Fujimoto M，Sato S.B lymphocytes and systemic sclerosis［J］.Curr Opin Rheumatol，2005，17（6）：746-751.

［13］ Zhang X，Ing S，F(xiàn)raser A，et al.Follicular helper T cells：new insights into mechanisms of autoimmune diseases［J］.Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

［14］ Matsushita T，Horikawa M，Iwata Y，et al.Regulatory B cells（B10cells）and regulatory T cells have independent roles in controlling experimental autoimmune encephalomyelitis initiation and late-phase immunopathogenesis［J］.J Immunol，2010，185（4）：2240-2252.

［15］ Mishima Y，Ishihara S，Aziz MM，et al.Decreased production of interleukin-10and transforming growth factor-βin Toll-like receptor-activated intestinal B cells in SAMP1／Yit mice［J］.Immunology，2010，131（4）：473-487.