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        糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠模型的建立及其認(rèn)知功能障礙觀察*

        2015-03-05 05:53:24任智晶
        重慶醫(yī)學(xué) 2015年16期
        關(guān)鍵詞:海馬功能障礙神經(jīng)元

        汪 峰,何 玉,劉 宓,常 嘯,任智晶,潘 衛(wèi),李 興

        (貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 550004)

        糖尿病對(duì)于人體健康危害極大,隨著病程的發(fā)展,部分患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能和行為缺陷等障礙,嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。鐘遠(yuǎn)等[1]研究顯示,慢性高血糖是認(rèn)知功能損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Leibson等[2]研究顯示,糖尿病患者中老年性癡呆的發(fā)病率明顯高于正常老年人。Cukierman等[3]的研究顯示,糖尿病患者認(rèn)知功能明顯低于非糖尿病患者,其認(rèn)知功能損傷的概率是非糖尿病患者的1.5倍,未來發(fā)生癡呆的概率是后者的1.6倍。但是目前人們對(duì)于糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚不是十分清楚,臨床上也無規(guī)范、特異的方法來診斷該病。因此建立一個(gè)良好的糖尿病伴認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型,對(duì)于進(jìn)一步研究糖尿病認(rèn)知功能損害很有意義。

        本研究通過大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)形成糖尿病大鼠模型,觀察糖尿病大鼠認(rèn)知功能的變化,并確立糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠模型建立的時(shí)間,為糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙的研究提供一種較好的工具。

        1 材料與方法

        1.1 材料及主要試劑 健康清潔級(jí)SD 大鼠,雄性,體質(zhì)量180~220g(貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心);血糖儀及血糖試紙(美國(guó)雅培公司);STZ(美國(guó)Sigma公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 腹腔注射STZ 誘導(dǎo)SD 大鼠形成糖尿病 研究選擇72只雄性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)挑選無認(rèn)知功能障礙的大鼠,同時(shí)采集尾部靜脈血測(cè)定大鼠空腹血糖,血糖值在3.0~5.0mmol/L。將大鼠分為6組:3 個(gè)對(duì)照組(第6、9、12 周組)和3 個(gè)模型組(第6、9、12周組),每組12 只。模型組大鼠在禁食12h后腹腔注射0.1 mol/L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.2)溶解的STZ(按50mg/kg劑量)1 mL,對(duì)照組大鼠則注射等量的0.1mol/L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(復(fù)制糖尿病大鼠模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為:注射STZ 溶液72h后空腹血糖大于或等于16.7mmol/L[4-5],且連續(xù)3 周其空腹血糖保持在16.7mmol/L 以上[6])。

        1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知功能 分別在成模后的第6、9、12周采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能。通過定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)來分析SD 大鼠的認(rèn)知功能。

        1.2.3 動(dòng)脈灌注法取材及光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察 通過動(dòng)脈灌注的方法留取大鼠海馬組織,固定后制作組織切片并進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;用專用電鏡固定液繼續(xù)固定后制作超薄組織切片并染色,透射電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

        1.2.4 其他樣本的留取 血清樣本:采用股動(dòng)脈放血法收集血液4~5mL,并及時(shí)分離血清后置-80 ℃保存待用。組織樣本:斷頭取腦,分別分離大鼠海馬組織及腦血管(基底動(dòng)脈)并置-80 ℃保存待用。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料采用±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 大鼠的空腹血糖結(jié)果 與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠比較,模型組大鼠的空腹血糖水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。

        表1 各組大鼠空腹血糖結(jié)果(±s,mmol/L)

        表1 各組大鼠空腹血糖結(jié)果(±s,mmol/L)

        a:P<0.01,與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較。

        組別 n 造模前造模后6 周 9 周 12周對(duì)照組36 3.64±0.52 4.04±0.63 4.27±0.44 4.23±1.02模型組 36 3.81±0.50 18.6±1.29a 19.0±1.36a 22.1±2.53 a

        2.2 大鼠體質(zhì)量和大腦質(zhì)量以及兩者之間的比值 與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠比較,模型組大鼠的大腦質(zhì)量明顯減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);模型組大鼠的體質(zhì)量較同時(shí)間的對(duì)照組明顯減輕,大腦質(zhì)量與體質(zhì)量的比值明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

        2.3 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠比較,模型組大鼠的逃避潛伏期和首次穿越時(shí)間均明顯增加,穿越次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。

        表2 各組大鼠的體質(zhì)量和大腦質(zhì)量以及兩者之間的比值結(jié)果(±s,n=36)

        表2 各組大鼠的體質(zhì)量和大腦質(zhì)量以及兩者之間的比值結(jié)果(±s,n=36)

        a:P<0.05,b:P<0.01,與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較。

        項(xiàng)目6周對(duì)照組 模型組9周對(duì)照組 模型組12周對(duì)照組 模型組大腦質(zhì)量(g) 1.352±0.05 1.304±0.03a 1.401±0.06 1.258±0.04b 1.447±0.07 1.167±0.04 b體質(zhì)量(g) 314.2±19.2 220.5±22.7a 367.4±22.9 196.6±26.9b 408.9±23.3 178.0±32.2b大腦質(zhì)量/體質(zhì)量 0.004 3±0.000 2 0.006 0±0.000 5a 0.003 8±0.000 2 0.006 5±0.000 8b 0.003 5±0.000 2 0.006 7±0.001 0 b

        表3 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=36)

        表3 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=36)

        a:P<0.01,與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較。

        項(xiàng)目6周對(duì)照組 模型組9周對(duì)照組 模型組12周對(duì)照組 模型組逃避潛伏期(s) 10.16±4.86 16.06±8.58a 9.92±4.54 19.27±10.13a 10.26±6.50 24.02±11.82 a首次穿越時(shí)間(s) 7.40±3.08 13.84±6.40a 7.28±3.45 15.43±8.09a 8.02±5.14 21.93±13.19a穿越次數(shù)(n) 4.46±2.48 2.88±1.95a 4.71±2.48 2.63±1.66a 4.79±2.53 2.56±1.32 a

        圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)

        2.4 大鼠海馬組織透射電鏡觀察結(jié)果 各時(shí)間段對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)豐富,分布均勻,核仁明顯,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)則,網(wǎng)腔均勻一致,線粒體數(shù)量較多,排列密集;模型組大鼠從成模后第6 周開始至第12 周,其海馬神經(jīng)元細(xì)胞逐漸出現(xiàn)細(xì)胞體積變小,核膜皺縮,核內(nèi)染色質(zhì)分布不均,顆?;蓧K并邊集,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔擴(kuò)張,分布不規(guī)則,線粒體腫脹,呈不規(guī)則形,雙層膜結(jié)構(gòu)不清,并且這些形態(tài)學(xué)改變隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)日趨明顯,見圖3。

        2.5 大鼠海馬組織切片HE 染色觀察結(jié)果 各時(shí)間段對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞(主要是錐體細(xì)胞)形態(tài)均較正常,大多呈圓形或橢圓形,細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞質(zhì)淡染、呈嗜堿性,且排列規(guī)則有序;成模后第6周及第9周的模型組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比并未見明顯異常,但成模后第12周模型組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了較明顯的異常,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量有所減少,細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核碎裂或者消失,細(xì)胞排列紊亂疏松,見圖4。

        圖4 對(duì)照組與模型組大鼠海馬CA1區(qū)的組織學(xué)改變(HE×400)

        3 討 論

        隨著糖尿病的發(fā)生,許多糖尿病患者的認(rèn)知能力會(huì)出現(xiàn)不同程度下降,尤其在老年人中正在成為一個(gè)不容忽視的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題。Dalai等[7]研究顯示,糖尿病時(shí)血管內(nèi)皮功能和血小板凝集功能障礙加重,導(dǎo)致血管內(nèi)皮增殖和血漿粘稠度增加,從而出現(xiàn)腔隙性腦梗死及腦血栓等并發(fā)癥。而糖尿病的慢性毒性作用會(huì)導(dǎo)致微血管受損,數(shù)目減少,基底膜增厚,血腦屏障完整性受到破壞,影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和血流不暢,進(jìn)而導(dǎo)致腦組織受損[8]。糖尿病患者由于糖代謝紊亂,會(huì)導(dǎo)致腦血管改變,進(jìn)而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng),使得大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面發(fā)生病理改變,最終可能形成以獲得性認(rèn)知功能和行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發(fā)癥,即糖尿病腦?。?-10]。因此,建立穩(wěn)定可靠的糖尿病認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型,對(duì)于該病的進(jìn)一步研究顯得十分重要和必要。自1960年開始有研究人員利用STZ誘發(fā)動(dòng)物制作糖尿病模型以來[11],STZ已成為當(dāng)前廣泛采用的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。但STZ誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型的成功率受諸多因素影響,包括給藥的劑量、給藥方法、STZ的溶劑以及大鼠的品種等,因此造模的成功率也有所不同。一般認(rèn)為,一次性大劑量(50~90 mg/kg)的STZ腹腔或靜脈注射可直接破壞胰島β細(xì)胞導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生,其具有簡(jiǎn)便、用藥量小、藥物毒性較低、胰島β細(xì)胞損傷特異性高等諸多優(yōu)點(diǎn)。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)采用50mg/kg的STZ劑量及pH 4.2、0.1mol/L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行溶解對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射的成模率高、死亡率低[12]。

        盡管目前有關(guān)糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚,直接建立糖尿病腦病動(dòng)物模型還存在著諸多困難,但已有研究表明,神經(jīng)細(xì)胞的變性和凋亡導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目減少是癡呆以及其他中樞神經(jīng)變性性疾病發(fā)生認(rèn)知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)[13]。因此,在此認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上,本研究首先采用STZ(按50mg/kg的劑量)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,在成模后的不同時(shí)間段進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示,模型組大鼠的逃避潛伏期、首次穿越時(shí)間均明顯比對(duì)照組延長(zhǎng)或增加,而穿越次數(shù)則明顯比對(duì)照組減少,說明所復(fù)制的糖尿病大鼠已經(jīng)發(fā)生了不同程度的學(xué)習(xí)記憶功能障礙,且隨著病程的延長(zhǎng)其學(xué)習(xí)記憶功能障礙也表現(xiàn)得越來越明顯和嚴(yán)重;不同時(shí)間段各組大鼠的海馬組織分別用透射電子顯微鏡以及HE 染色后用普通光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)上的變化顯示,隨著模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙程度的增加,與同時(shí)間段的對(duì)照組比較,其海馬神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)上的改變?cè)絹碓矫黠@,且數(shù)量也在減少,這說明海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的加快與其認(rèn)知功能障礙程度的加重息息相關(guān),存在著因果關(guān)系。王憲玲等[14]在對(duì)自發(fā)性2型糖尿病小鼠進(jìn)行研究時(shí)也得出了類似的結(jié)果。此外,通過對(duì)模型組大鼠大腦質(zhì)量的分析可以看出,隨著糖尿病病程的延長(zhǎng),特別是從成模后第六周開始,與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠相比較,其大腦質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這與Bao等[15]的研究結(jié)果相似。我們的研究結(jié)果表明,通過以上方法來建立糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙大鼠模型的方法是科學(xué)和合理的。

        本研究通過對(duì)模型組大鼠的動(dòng)態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠從第6周開始出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙,并隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性加重。采用透射電子顯微鏡及HE 染色等手段對(duì)其海馬組織進(jìn)行觀察,海馬神經(jīng)元細(xì)胞從發(fā)病后第6周開始出現(xiàn)凋亡前的形態(tài)學(xué)改變,并隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而日趨明顯。但成模后第6周及第9周的模型組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比并未見明顯異常,而成模后第12周的模型組大鼠海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)則出現(xiàn)了較明顯的異常,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量有所減少,細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核碎裂或者消失,細(xì)胞排列紊亂疏松。

        以上結(jié)果表明,利用STZ誘導(dǎo)SD 大鼠形成糖尿病后,隨著病情的發(fā)展,糖尿病大鼠逐漸出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙。至第12周,其大腦海馬神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了明顯變化,并出現(xiàn)了相應(yīng)的行為學(xué)改變,因此可以將該時(shí)間段作為糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙大鼠模型的建立時(shí)間。

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