張文斌，朱成均，石 泉，趙振海

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，廣西桂林541001）

心臟瓣膜置換術(shù)后常伴有黏附分子的消耗及炎性因子的級聯(lián)釋放，導(dǎo)致心肌發(fā)生炎性反應(yīng)，出現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷、凋亡和壞死［1］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，廣泛存在于心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等各種細(xì)胞內(nèi)，主要參與機體防御功能及炎性反應(yīng)有關(guān)的早期應(yīng)答因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6及IL-8等的表達(dá)調(diào)控［2］。研究表明，前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）可通過調(diào)節(jié)炎性因子水平，抑制炎性反應(yīng)［3-4］。本研究擬觀察PGE1對心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌細(xì)胞NF-κB活性及血漿TNF-α水平的影響，以闡明其減輕心臟瓣膜置換術(shù)心肌損傷的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年2月至2013年4月，在本院擇期行體外循環(huán)下心臟瓣膜置換術(shù)的患者40例，男23例，女17例，年齡32～67歲，體質(zhì)量指數(shù)17～28kg／m2，美國麻醉師協(xié)會（ASA）分級Ⅱ或Ⅲ級，紐約心臟病協(xié)會（NYHA）分級Ⅱ或Ⅲ級，左室射血分?jǐn)?shù)大于或等于30%，無高血壓、冠心病和糖尿病病史，無心臟手術(shù)史。采用隨機數(shù)字表法，將患者隨機分為2組（n＝20）：對照組（C組）和PGE1組（P組）。兩組患者的年齡、性別比、體質(zhì)量指數(shù)、ASA 分級、體外循環(huán)時間、主動脈阻斷時間和手術(shù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 麻醉和體外循環(huán) 麻醉前30min肌肉注射東莨菪堿0.3mg。入室后監(jiān)測心電圖（ECG）、血壓（BP）和血氧飽和度（SpO2）。建立外周靜脈通道。靜脈注射咪達(dá)唑侖0.1～0.3 mg／kg、芬太尼8～10μg／kg和依托咪酯0.3 mg／kg麻醉誘導(dǎo)，待患者睫毛反射消失后靜脈注射維庫溴銨0.12 mg／kg。氣管插管后行機械通氣，潮氣量8～10mL／kg，通氣頻率10～12 次／min，維持PETCO235～45mm Hg。行左側(cè)橈動脈及右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺置管，分別用于監(jiān)測平均主動脈壓（MAP）和中心靜脈壓（CVP）。靜脈輸注咪達(dá)唑侖0.5～1.0μg·kg-1·min-1，芬太尼0.1～0.2μg·kg-1·min-1和維庫溴銨0.8～1.2μg·kg-1·min-1維持麻醉，維持心率和血壓平穩(wěn)，使其波動幅度不超過基礎(chǔ)值的20%。常規(guī)建立體外循環(huán)，中度血液稀釋（紅細(xì)胞壓積為0.20～0.25），中心體溫降至28 ℃，體外循環(huán)期間MAP維持在50～80mm Hg，心肌保護采用間斷正向灌注冷血高鉀心臟停搏液（氯化鉀濃度為20mmol／L），方法同文獻(xiàn)［4］?；颊咝g(shù)后送返監(jiān)護室，于循環(huán)穩(wěn)定、自主呼吸恢復(fù)并穩(wěn)定，且動脈血氣分析無異常后拔除氣管導(dǎo)管。

表1 兩組患者不同時點血漿TNF-α水平的比較（±s，μg／L，n＝20）

表1 兩組患者不同時點血漿TNF-α水平的比較（±s，μg／L，n＝20）

aP＜0.01，與T0 比較；b P＜0.05，與C組比較。

組別 T0 T1 T2 T3 T 4 C組 6.57±2.28 54.33±18.98a 94.64±23.16a 135.44±32.76a 115.67±29.68 a P組 7.21±1.94 37.25±14.65ab 72.18±20.55ab 102.54±27.37ab 87.49±22.57 ab

圖1 兩組患者不同時點心肌組織病理學(xué)變化的比較（HE×100）

1.2.2 干預(yù)方法 P組在麻醉誘導(dǎo)后靜脈輸注PGE1（北京泰德制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H10980024，產(chǎn)品批號：2011H）20ng·kg-1·min-1，直至手術(shù)結(jié)束；C 組給予等容量生理鹽水。

1.2.3 ELISA 檢測血漿TNF-α水平 于體外循環(huán)前（T0，基礎(chǔ)值），體外循環(huán)開始后30min（T1），體外循環(huán)結(jié)束時（T2），體外循環(huán)結(jié)束后12h（T3）、24h（T4）抽取動脈血3mL，即刻在4℃下以3 000r／min離心10min，取上清液，置入-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測血漿TNF-α水平。采用雙抗體夾心ELISA 法測定TNF-α水平，試劑盒來自美國Santa Cruz公司。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測右心耳組織NFκB的活性 于T0和T2時剪取未被鉗夾或結(jié)扎的右心耳組織，分為2份。第1份立即浸入10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。第2份用液氮冷凍后-80℃保存，采用Western blot檢測NF-κB的表達(dá)：將心肌組織均漿后提取心肌蛋白，Lowry法測定蛋白含量。取100μg心肌蛋白置于12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，膜在封閉液中室溫作用3h。再加入小鼠NFκB抗體，4 ℃孵育過夜，用TBST 緩沖液沖洗15 min，共3次后，加入二抗羊抗兔IgG，室溫?fù)u動孵育1h，再用TBST 緩沖液充分沖洗，最后進(jìn)行增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。將PVDF 膜上顯影的條帶掃描入電腦，結(jié)合圖像分析軟件分析NF-κB的表達(dá)，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用成組t檢驗，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者不同時點血漿TNF-α水平的比較 與T0比較，兩組血漿TNF-α水平T1時開始升高（P＜0.05），T3時達(dá)峰值（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與C組比較，P組在T1～T4時點血漿TNF-α水平明顯下降（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 兩組患者不同時點心肌組織病理學(xué)變化的比較 T0時兩組心肌結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰，少見炎性細(xì)胞。T2時C組心肌細(xì)胞腫脹，排列紊亂，大量肌原纖維斷裂，并可見大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯細(xì)胞壞死及間質(zhì)纖維化；T2時P組心肌細(xì)胞輕度腫脹，部分肌原纖維斷裂，排列略紊亂，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤較少，病理學(xué)改變明顯輕于C組。見圖1。

2.3 兩組患者不同時點心肌細(xì)胞NF-κB活性的比較 與T0比較，T2時兩組心肌細(xì)胞NF-κB活性明顯升高（P＜0.05）；與C組比較，T2時P 組心肌細(xì)胞NF-κB 活性明顯下降（P＜0.05）。見圖2，表2。

圖2 Western blot檢測兩組患者不同時點心肌細(xì)胞NF-κB活性

表2 兩組患者不同時間點心肌細(xì)胞NF-κB表達(dá) 的比較（±s，%，n＝20）

表2 兩組患者不同時間點心肌細(xì)胞NF-κB表達(dá) 的比較（±s，%，n＝20）

a：P＜0.05，與T0 比較；b：P＜0.05，與C組比較。

組別 T0 T 2 C組 17.6±5.5 92.4±12.7 a P組 18.7±5.2 85.4±13.4 ab

3 討 論

心臟瓣膜置換術(shù)造成心肌細(xì)胞損傷的原因，除心內(nèi)操作所致的機械損傷和心肌缺血再灌注損傷外，心肌炎性反應(yīng)也是其中重要的因素［1］。在心臟瓣膜置換術(shù)中采用有效的心肌保護措施，已成為心臟外科的研究熱點。

PGE1是一種有效的血管擴張劑，既往主要用于肺動脈高壓的治療［5］，隨著臨床研究的深入，多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)PGE1具有穩(wěn)定生物膜、抑制中性粒細(xì)胞活性、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和缺血再灌注損傷等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PGE1可靶向擴張病變血管，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平，減少血栓素A（TXA）合成，可以抑制神經(jīng)末梢釋放去甲狀腺腎上腺素，抑制血小板聚集，防止凝血因子大量釋放導(dǎo)致的血栓形成。它可以抑制氧自由基的活化與遷移，可以增加超氧化物歧化酶（SOD）的含量，防止組織內(nèi)缺血再灌注損傷的發(fā)生；它可以通過降低血漿內(nèi)皮素、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞［6］，顯著降低炎癥細(xì)胞介質(zhì)因子，防止全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）的發(fā)生，降低多器官損傷的可能，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP，激活腺苷酸環(huán)化酶，抑制TNF-α的釋放。PGE1之所以能夠減少促炎癥介質(zhì)的釋放主要與其能夠抑制炎癥介質(zhì)或因子等相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，還與增加組織溶酶體酶與cGMP的釋放作用有關(guān)［7］。此外，它可能是通過抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子表達(dá)降低。大劑量的PGE1有明顯的降壓作用，而Nacije等［8］證實小劑量持續(xù)應(yīng)用時（輸注濃度小于或等于40ng·kg-1·min-1）時，對體循環(huán)血壓無明顯影響。因此，本研究選用20ng·kg-1·min-1靜脈輸注，實驗過程中未見與PGE1相關(guān)的血壓波動。

NF-κB在心功能下降、心肌炎性反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡等病理生理過程中發(fā)揮重要作用［9］。正常生理情況下，NF-κB與其抑制物IκB結(jié)合，以無活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到外界信號刺激后，IκB和NF-κB解離，游離的NF-κB快速進(jìn)入細(xì)核內(nèi)，與靶基因κB位點結(jié)合，迅速誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)TNF-α、IL-6 和IL-8 等 多 種 炎 癥 因 子 水 平，加 重 細(xì) 胞 損傷［10］。李欣等［11］的臨床研究顯示，心肌損傷可使患者體內(nèi)NF-κB激活，NF-κB活性在心肺復(fù)蘇后多臟器功能障礙綜合征組和死亡組明顯高于存活組。在本實驗中，麻醉誘導(dǎo)后靜脈PGE1 20ng·kg-1·min-1至手術(shù)結(jié)束相較于誘導(dǎo)后靜脈給予生理鹽水在手術(shù)結(jié)束時心肌細(xì)胞的NF-κB 活性明顯降低。因此作者推測輸注PGE1 可能通過介導(dǎo)NF-κB的下調(diào)在體外循環(huán)中起到心肌保護的作用。

細(xì)胞炎癥因子（如TNF-α、IL-6和IL-8等）的水平可反映炎性反應(yīng)的劇烈程度［12］。TNF-α是一種關(guān)鍵的炎性介質(zhì)，在炎性級聯(lián)反應(yīng)中起主導(dǎo)作用，其主要由巨噬細(xì)胞以自分泌形式產(chǎn)生，但缺血心肌細(xì)胞本身也可產(chǎn)生TNF-α，加重心肌炎性反應(yīng)，造成心肌損傷［13］。TNF-α通過中性粒細(xì)胞依賴性和非中性粒細(xì)胞依賴性機制，導(dǎo)致血管通透性增加［14］。TNF-α介導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集，可能是通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)ICAM1表達(dá)和E-選擇素內(nèi)皮表達(dá)［15］，介導(dǎo)多形核中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附，上調(diào)中性粒細(xì)胞糖蛋白黏附分子和它們的內(nèi)皮配位子，使其游動黏附內(nèi)皮，激發(fā)中性粒細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞釋放大量損傷介質(zhì)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞發(fā)生氧化爆發(fā)、脫顆粒，引起血管和組織損傷。在本實驗中，麻醉誘導(dǎo)后靜脈輸注PGE1 20ng·kg-1·min-1至手術(shù)結(jié)束相較于誘導(dǎo)后靜脈給予生理鹽水在體外循環(huán)后30 min、手術(shù)結(jié)束時及其手術(shù)后12h血漿內(nèi)的TNF-α表達(dá)水平明顯降低。因此推測輸注輸注PGE1 可能引起體外循環(huán)過程中機體內(nèi)血漿TNF-α的表達(dá)降低，進(jìn)而減少炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而起到心肌保護的作用。

心肌組織病理學(xué)結(jié)果顯示，與C 組比較，P 組心肌組織結(jié)構(gòu)破壞較輕，炎性細(xì)胞浸潤較少，心肌細(xì)胞受損程度相對較輕。本研究結(jié)果還顯示，心臟瓣膜置換術(shù)可升高心肌細(xì)胞NF-κB活性及血漿TNF-α水平，但P組各時點NF-κB活性和TNF-α水平均明顯低于C 組，說明PGE1可抑制心肌細(xì)胞NF-κB 活性，減少血漿TNF-α水平，從而減輕心肌損傷。

綜上所述，PGE1可減輕心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌損傷，其機制可能與抑制心肌細(xì)胞NF-κB 活性，減少血漿TNF-α水平有關(guān)。但前列腺素E1可引起NF-κB 表達(dá)變化的上游通路靶點以及NF-κB表達(dá)與血漿TNF-α表達(dá)水平是否存在相關(guān)性還有待進(jìn)一步的研究。

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