楊才志　陳勝賢　黃錦菁　吳紹鋒(廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東　廣州　50405)

水蛭素對小鼠EOMA血管瘤細胞體外增殖及凋亡的影響

楊才志陳勝賢黃錦菁吳紹鋒1
(廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州510405)

〔摘要〕目的探討水蛭素作用于小鼠EOMA血管瘤細胞的抑制作用及其機制。方法體外培養(yǎng)EOMA細胞，使用不同濃度水蛭素作用于EOMA細胞48 h，應用噻唑藍(MTT)法、流式細胞術檢測細胞存活率和細胞凋亡情況，觀察水蛭素對EOMA細胞的抑制作用，并篩選出水蛭素的最適抑制濃度，比較水蛭素和平陽霉素(PYM)單用對EOMA細胞的抑制率。結果相較于溶劑對照組，EOMA細胞存活率隨水蛭素濃度增加而逐漸下降，至藥物濃度為4 U/ml時有顯著差異(P＜0.05)。結論水蛭素在體外可有效抑制小鼠EOMA血管瘤細胞的增殖并促進其凋亡，這一作用呈現明顯的劑量效應關系。

〔關鍵詞〕水蛭素;血管瘤; EOMA;增殖;凋亡

1廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院

第一作者:楊才志(1992-)，男，主要從事臨床醫(yī)學研究。

血管瘤是嬰幼兒時期常見的血管性腫瘤，新生兒發(fā)病率約為10％～12％〔1〕。根據Ji等〔2〕關于血管瘤生成的理論，這是一種血管內皮細胞和周細胞異常增殖導致的病變，因此可以考慮應用血管內皮生成抑制藥物加以干預和治療。本研究利用小鼠血管瘤內皮細胞株(EOMA)初步探討水蛭素的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要實驗儀器與材料①CO2培養(yǎng)箱:美國FORMA公司3111;②倒置顯微鏡:奧林巴斯株式會社CKX41;③酶標儀:六一公司;④流式細胞儀。

1.1.2細胞、藥品和主要試劑①小鼠EOMA血管瘤細胞:廣州吉妮歐生物科技有限公司;②RPMI-1640培養(yǎng)基: GIBCO公司，批號20100923;③pen strep青鏈雙抗: GIBCO公司，批號201010;④溴化噻唑藍四唑(MTT) : BIOSHARP公司，min＞98％;⑤天然水蛭素:鄭州英諾生物科技有限公司，min≥95％，批號11111101;⑥0.25％ trypsin胰酶: GIBCO公司，批號201103;⑦newborn calf serum牛血清: GIBCO公司，批號201310;⑧注射用鹽酸平陽霉素(PYM) :上海通用藥業(yè)股份有限公司;⑨二甲基亞楓(DMSO) : BIOSHARP公司，min＞99.5％，1.10 g/ml。

1.2方法

1.2.1藥液配制(1)水蛭素原液:用培養(yǎng)液溶解成32 U/ml濃度原液保存，使用時用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度。(2) PYM原液:用培養(yǎng)液溶解成800 μg/ml濃度原液保存，使用時用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度。(3) 5 mg/ml MTT溶液:用無血清1640培養(yǎng)基按5 mg/ml配制。(4)碘化丙啶(PI)染液:用磷酸鹽緩沖液(PBS)按50 U/ml PI、50 U/ml RNaseA配制。

1.2.2細胞培養(yǎng)EOMA細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基〔含10％滅活小牛血清、1％雙抗(青霉素、鏈霉素)〕中，置37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.3MTT法檢測水蛭素對EOMA細胞增殖抑制作用取對數生長期EOMA細胞，用含血清的1640培養(yǎng)液稀釋成濃度為4×104個/ml的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的水蛭素使其終濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 U/ml，陽性藥物對照孔加入PYM溶液使PYM的終濃度分別為200、100 μg/ml，溶劑及細胞對照孔加入無血清1640培養(yǎng)液，以上每組各設4復孔。培養(yǎng)36 h和48 h后吸出各孔培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/ml MTT 100 μl(避光)，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入DMSO完全顯色后，酶標儀測定光密度值(OD值)。以溶劑處理的細胞為對照組，計算水蛭素對細胞的抑制率和半數抑制濃度IC50。

1.2.4流式細胞術檢測不同濃度水蛭素作用48 h后EOMA細胞凋亡率取對數生長期生長良好的細胞，用含血清的1640培養(yǎng)基配制成濃度為2×104個/ml的細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入不同濃度的水蛭素使其最終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25 U/ml，細胞對照組加入無血清1640培養(yǎng)基，每組設3個復孔，處理48 h。收集處理后的細胞培養(yǎng)液至離心管;加1 ml PBS清洗1次，清洗液加入管中;胰酶消化收集細胞于管中; 1 ml PBS清洗剩余細胞1次，清洗液加入離心管;用同一離心管收集上述得到的細胞液。1 000 r/min離心5 min，棄上清;重懸細胞后再次離心棄上清，用PBS重懸細胞，將細胞加入預冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70％，4℃避光固定30 min以上; 1 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS清洗2次;加500 μl含50 μl/ml PI、50 μl/ml RNaseA 的PI染液(PBS配制)，避光孵育30 min。流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

2　結果

2.1MTT檢測水蛭素作用于小鼠EOMA血管瘤細胞36 h、48 h后的抑制率作用48 h后，隨濃度增加，水蛭素對EOMA細胞的抑制率逐漸升高;與溶劑對照組相比，藥物濃度為0.25 U/ml時細胞抑制率(IR)為44.005％，有顯著性差異(P＜0.05) ;繼續(xù)增加至4 U/ml時，IR為99.617％，36 h組和48 h兩組變化趨勢相似，可認為不同濃度的水蛭素對小鼠EOMA血管瘤細胞IR的影響不同，呈現明顯的劑量-時間依賴性。見表1。

2.2流式細胞術檢測不同濃度水蛭素作用于小鼠EOMA血管瘤細胞48 h后的細胞周期分布流式細胞術結果與MTT實驗結果一致:與溶劑對照組對比，給藥48 h后不同濃度組的水蛭素對G2/M期EOMA細胞有誘導凋亡的作用。對比溶劑對照組，不同濃度水蛭素組G1峰前方均出現亞二倍峰(凋亡峰)，表明被誘導的凋亡細胞增加;不同濃度水蛭素組G1/S/G2期細胞數占總數的比例相比溶劑對照組均有明顯變化，G1期細胞數占總數比例明顯上升，而G2期細胞數占總數比例均有不同程度的明顯下降，可以看出給藥后小鼠EOMA血管瘤細胞分裂合成受到限制或破壞，即水蛭素對小鼠EOMA血管瘤細胞有明顯的誘導凋亡的作用。見表2。

表1　水蛭素、PYM作用于EOMA血管瘤細胞36、48 h后光密度值及細胞抑制率的變化(±s)

表1　水蛭素、PYM作用于EOMA血管瘤細胞36、48 h后光密度值及細胞抑制率的變化(±s)

組別　36 h 48 h OD492　 IR(％)　 OD492　 IR(％)溶劑對照組　0.322±0.017　　－　0.392±0.024　?。嗡?.25 U/ml 0.317±0.018　 1.630　 0.220±0.009　 44.005水蛭素0.5 U/ml 0.296±0.015　 8.075　 0.182±0.012　 53.571水蛭素1 U/ml　 0.221±0.015　 31.522　 0.153±0.040　 60.969水蛭素2 U/ml　 0.126±0.018　 60.792　 0.062±0.022　 84.120水蛭素4 U/ml　 0.055±0.023　 82.842　 0.002±0.001　 99.617 PYM 100 μg/ml　 0.040±0.024　 87.733　 0.044±0.024　 88.903 PYM 200 μg/ml　 0.037±0.026　 88.665　 0.040±0.026　 89.732

表2　流式細胞儀檢測不同濃度水蛭素作用于小鼠EOMA血管瘤細胞周期分布(％)

3　討論

血管瘤形成的機制是血管內皮細胞的增殖和血管生成〔3〕。因此，可以通過抑制血管內皮細胞的增殖、減少局部血管的生成來控制血管瘤的發(fā)生發(fā)展，從而達到治療血管瘤的目的。

EOMA細胞是129P3/J小鼠來源的血管瘤內皮細胞〔4〕，主要由這種異常增殖的血管內皮細胞構成EOMA血管瘤，目前常用于構建血管瘤實驗動物及細胞培養(yǎng)模型〔5〕。水蛭是一種傳統(tǒng)中藥，《中國藥典》記載水蛭具有破血通經，逐瘀消癥的功效〔6〕，廣泛用于活血化瘀的組方中?，F代研究表明，水蛭唾液腺分泌的水蛭素是一種由65個氨基酸組成的單鏈多肽，能以1∶1的方式與凝血酶結合，使其失去凝血功能〔7〕。大量實驗證明，水蛭素是世界上已知的最有效的天然凝血酶抑制劑〔8〕。目前有研究表明水蛭提取物對凝血酶誘導的恒河猴視網膜脈絡膜血管內皮細胞(RF-6A細胞)的增殖有抑制作用〔9〕。并且水蛭提取物能顯著抑制腫瘤血管的生成及血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達〔10〕?？梢娝嗡厥悄傅奶禺愋砸种苿?，可抑制凝血酶對內皮細胞刺激誘導血管生成的作用，降低VEGF的表達，從而抑制血管內皮細胞的增殖、減少新型血管的生成。而進一步的現代臨床研究表明，水蛭素還對血管瘤具有治療作用，顏德馨老中醫(yī)以水蛭粉為主藥制成消瘤丸治療血管瘤〔11〕，但其具體療效及治療機制尚不清楚。

本實驗研究結果表明，水蛭素能在體外明顯地抑制EOMA血管瘤內皮細胞的增殖，并且隨著作用時間和濃度的增加，其抑制作用也增強，對EOMA細胞的抑制率增高，抑制率與藥物濃度存在依賴關系。水蛭素抑制細胞增殖的作用較PYM強。本研究初步證明水蛭素抑制血管瘤細胞生長的主要機制是誘導血管內皮細胞凋亡。由于機體內的巨噬細胞會迅速清除掉凋亡細胞，減少了炎癥反應的產生〔12〕，因此通過誘導凋亡而消滅血管瘤內皮細胞所產生的局部反應輕，對血管瘤治療的安全性有重要意義，也保證了血管瘤治療后的外觀恢復。

4　參考文獻

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〔2015-01-13修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:吳紹鋒(1979-)，男，實驗師，主要從事病理學與分子生物學技術研究。

基金項目:2012年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(No．201210572012) ; 2013年廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(No．1057213003)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4445-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.011