胡惠林　錢　鋼　唐關(guān)敏　周斌全(浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科，浙江　杭州　3006)

丹參酮ⅡA 對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后HMGB1的影響

胡惠林1錢鋼1唐關(guān)敏1周斌全
(浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州310016)

〔摘要〕目的探討丹參酮ⅡA(TSA)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法建立大鼠假手術(shù)組(SHAM組)，缺血再灌注模型(IR組)，低、中、高劑量TSA預(yù)處理組(L、M、H-TSA組)。蘇木素-伊紅(HE)法檢測(cè)心肌細(xì)胞病理變化、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血漿高遷移率族蛋白1(HMGB1)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的表達(dá)，RT-PCR、Western印跡檢測(cè)心肌HMGB1等的表達(dá)。結(jié)果較IR組相比，HE檢測(cè)TSA預(yù)處理后心肌病理變化減輕，血漿HMGB1等的表達(dá)減少，心肌HMGB1、TNF-α的表達(dá)減少，并且呈劑量依賴性。結(jié)論TSA預(yù)處理可以減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與減輕晚期炎癥因子HMGB1的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕心肌缺血再灌注損傷;丹參酮IIA;高遷移率族蛋白1

1嘉興市第一醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者:胡惠林(1979-)，男，副主任醫(yī)師，在職碩士，主要從事心肌缺血再灌注研究。

心肌缺血再灌注(IR)損傷〔1〕是指心肌缺血在重新恢復(fù)血流供應(yīng)后反而會(huì)造成心肌功能、超微結(jié)構(gòu)、電生理方面及代謝的進(jìn)一步損傷。丹參酮ⅡA(TSA)是從丹參中提取的一種具有抗缺氧的脂溶性成分，可以改善血液流變學(xué)特性、舒張冠狀動(dòng)脈、減輕心肌缺血、改善微循環(huán)等多種藥理作用〔2〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討TSA對(duì)心肌IR損傷的保護(hù)機(jī)制，研究其對(duì)晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1(HMGB1)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料Wistar雌性大鼠50只，5～8月齡，體重260～300 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào): SCXK(浙) 2013-0023;大鼠HMGB1、腫瘤壞死因子(TNF) -α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司) ; HMGB1、TNF-α兔多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司) ; RNA試劑提取盒和RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。丹參酮IIA購(gòu)于雅安三九藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)881010。

1.2大鼠IR模型建立和分組心肌IR大鼠模型建立:使用8％的水合氯醛腹腔內(nèi)注射(5 ml/kg)麻醉，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，心電監(jiān)護(hù)監(jiān)測(cè)平均心率和動(dòng)脈壓。用線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左室支左心耳下緣處，通過(guò)硅膠管結(jié)扎，阻斷冠狀血流約20 min，然后放松結(jié)扎線再灌約1 h，完成IR損傷模型。心電圖肢導(dǎo)聯(lián)的變化來(lái)判斷模型質(zhì)量，以ST段抬高＞0.5 mV為心肌缺血，松開(kāi)后，增高的R波振幅降低、伴有Q波出現(xiàn)或心律失常、抬高的ST段下降1/2以上判斷為再灌注損傷形成，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)分組: 50只大鼠隨機(jī)分為五組，假手術(shù)組(SHAM 組)，心肌I/R模型(IR組)，低、中、高劑量TSA預(yù)處理組(L、M、H-TSA組)，每組10只，其中TSA預(yù)處理組(L、M、H-TSA) TSA給藥方式為缺血再灌注前1 w腹腔注射TSA溶液，劑量分別為10、20、40 mg/kg。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測(cè)心肌病理變化取實(shí)驗(yàn)各組大鼠心臟，剪去右心室、心房及血管，保留室間隔心肌及左心室，心肌組織經(jīng)4％甲醛固定后，石蠟包埋，切片供HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌結(jié)構(gòu)變化。

1.4ELISA檢測(cè)各組血漿HMGB1、TNF-α的表達(dá)試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)間，暴露下腔靜脈，抽靜脈血進(jìn)行離心，根據(jù)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行操作。450 nm波長(zhǎng)下用酶聯(lián)儀依序測(cè)量各組光密度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)各組的實(shí)際濃度。

1.5RT-PCR法檢測(cè)各組心肌HMGB1、白細(xì)胞介素(IL) -6、TNF-α mRNA的表達(dá)按試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，采用Rotor gene3000熒光定量分析儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠HMGB1、MCP-1、TNF-α mRNA的表達(dá)。TNF-α正義引物5'CCCCTTTATCGTCTACTCCTC-3'，反義: 5'GCTGGTAGTTTAGCTCCGTTT-3'，長(zhǎng)度533 bp; IL-6正義: 5'GGATACCACCCACAACAGAC-3'，反義: 5' TTGCCGAGTAGACCTCATAG-3'，長(zhǎng)度520 bp; HMGB1正義: 5'GCATCCCAAGTACGAGTGGT-3'，反義: 5'GAAGGCGTAG CTGAACAAGG-3'，長(zhǎng)度700 bp; GAPDH，正義: 5' CCATCACTGCCACTCAGAAGA-3'，反義: 5' CATGAGGTCCACCACCCTGT-3'，長(zhǎng)度446 bp。

1.6Western印跡檢測(cè)各組心肌HMGB1蛋白的表達(dá)隨機(jī)選取5只大鼠，處死迅速取心肌。參照說(shuō)明書(shū)操作，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參。使用LabWork 4.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)、ANOVA分析、Dunnett-t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1HE染色法檢測(cè)心肌病理變化SHAM組大鼠心肌組織排列整齊，染色均勻，呈束狀，纖維完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜及細(xì)胞核完整，病理積分5.02±0.78。IR組大鼠心肌組織間質(zhì)水腫，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞可見(jiàn)大片狀壞死，心肌纖維部分有斷裂，邊界欠清，細(xì)胞出現(xiàn)破裂、濃縮、溶解現(xiàn)象，病理積分20.50±3.22，明顯高于SHAM組(P＜0.05)。而TSA組心肌纖維染色不均，間質(zhì)水腫，排列紊亂，部分細(xì)胞核有消失、濃縮現(xiàn)象，但與IR組相比明顯減輕，而且結(jié)果提示TSA劑量越大，心肌病理?yè)p傷越輕，L、M、H-TSA組病理積分分別為18.23± 2.86、15.56±2.47、8.15±1.88，明顯高于SHAM組，低于IR組(均P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　實(shí)驗(yàn)各組心肌病理變化

2.2ELISA檢測(cè)各組血漿HMGB1、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表達(dá)I/R后血漿HMGB1、MDA表達(dá)均明顯升高，SOD表達(dá)下降(P＜0.05) ; TSA組血漿HMGB1、DMA明顯低于IR組(P＜0.05)，SOD表達(dá)高于IR組，且劑量越高，損傷作用越輕。見(jiàn)表1。

2.3RT-PCR法檢測(cè)各組心肌HMGB1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)IR組后炎癥因子HMGB1、IL-6、TNF-α蛋白水平明顯升高(P＜0.05)，而TSA組炎癥因子HMGB1、IL-6、TNF-α蛋白水平要低于IR組(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

表1　ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組SOD、MDA、HMGB1的表達(dá)(±s，n=10)

表1　ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組SOD、MDA、HMGB1的表達(dá)(±s，n=10)

與SHAM組比較: 1) P＜0.05;與IR組比較: 2) P＜0.05;下圖同

組別　SOD(U/ml)　 MDA(nmol/ml)　 HMGB1(ng/ml) SHAM組　251.53±31.38　 3.72±0.95　 2.91±0.32 IR組　152.68±14.381)　6.18±0.681)　9.25±2.811)L-TSA組　181.14±21.251) 2)5.63±0.871) 2)　8.83±2.271) 2)M-TSA組　197.62±31.491) 2)4.64±0.741) 2)　6.57±1.981) 2)H-TSA組　224.58±24.561) 2)4.37±0.621) 2)　5.45±1.691) 2)

圖2　RT-PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組炎癥指標(biāo)的表達(dá)

2.4Western印跡檢測(cè)各組心肌HMGB1蛋白的表達(dá)IR組后炎癥因子HMGB1蛋白水平明顯升高(P＜0.05)，而TSA組炎癥因子HMGB1白水平要低于IR組(P＜0.05)，呈劑量依賴性。與GAPDH相比，SHAM組、IR組、L-TSA組、M-TSA組、H-TSA 組HMGB1相對(duì)含量分別為0.45±0.07，0.92±0.18，0.75± 0.10，0.62±0.08，0.55±0.04。見(jiàn)圖3。

圖3　Western印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組HMGB1的表達(dá)

3　討論

缺血心肌恢復(fù)血流后組織功能代謝障礙，結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，甚至發(fā)生不可逆性的損傷〔3〕，稱為心肌IR損傷，它引起的心功能障礙程度比急性心肌梗死更嚴(yán)重，死亡率更高，特別集中再老年人群。因此如何減輕心肌IR損傷，成為目前基礎(chǔ)和中醫(yī)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)一般采用辨證分型治療心肌缺血，分為心血瘀阻型、痰濁壅盛型、心陰兩虛型、心腎陽(yáng)虛型。

TSA是從中藥丹參中提取的一種脂溶性物質(zhì)，具有副作用小、作用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。以往的研究顯示，TSA可以抑制醛固酮的合成，預(yù)防高血壓性心臟病所致左室肥厚〔4〕，還可以減輕早期炎癥反應(yīng)ICAM-1和P-選擇素的表達(dá)，減輕IR損傷炎癥反應(yīng)〔5〕。陳清華等〔6〕報(bào)道TSA可以改善心血瘀阻證時(shí)心肌細(xì)胞染色以及心電圖改變;郭張強(qiáng)等〔7〕報(bào)道，TSA可以保護(hù)急性心肌梗死后無(wú)復(fù)流患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在無(wú)復(fù)流中具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。另有實(shí)驗(yàn)表明，TSA對(duì)大鼠缺糖缺氧性腦損傷均具有保護(hù)作用〔3〕。以上研究顯示丹參酮ⅡA對(duì)大鼠心肌IR損傷具有保護(hù)作用，但是其心肌保護(hù)作用的具體分子機(jī)制仍未被闡明，其是否與調(diào)控HMGB1有關(guān)仍未見(jiàn)報(bào)道。

HMGB1作為一種晚期炎性細(xì)胞因子，是致炎細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要中心環(huán)節(jié)，不僅能促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1等表達(dá)，還能激活JNK激酶、ERK激酶、P38MAPK激酶，促使核轉(zhuǎn)錄因子(NF) -κB核移位〔8〕。Hu等〔9〕研究表明HMGB1預(yù)處理可以降低大鼠心梗面積，減少IL-6以及LDH的表達(dá)，保護(hù)心肌IR損傷。Oozawa等〔10〕給予外源性HMGB1單克隆抗體，干預(yù)IR心肌后，血漿心肌酶升高、心肌梗死面積擴(kuò)大。Kim等〔11〕研究證實(shí)抗HMGB1抗體可以減輕善缺血后腦梗死損傷。HMGB1作為炎癥因子，在IR損傷中的重要作用，因此尋找一種能夠調(diào)控HMGB1的方法，減輕心肌IR損傷，就是以HMGB1為切入點(diǎn)，深入研究TSA對(duì)心肌IR后HMGB1的影響。

本研究提示TSA預(yù)處理有心肌保護(hù)的作用;丹參酮預(yù)處理可以減輕I/R損傷，降低血漿HMGB1等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，抑制心肌HMGB1表達(dá)，減少心肌炎癥反應(yīng)。

4　參考文獻(xiàn)

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〔2014-03-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:周斌全(1971-)，男，主任醫(yī)師，主要從事心肌缺血再灌注研究。

基金項(xiàng)目:浙江省嘉興市科技研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013AY21042-6)

〔中圖分類號(hào)〕R541.4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 15-4185-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.033