段永強(qiáng)　梁玉杰　成映霞　杜　娟　楊曉軼　程衛(wèi)東　劉　靚　高建德　安耀榮　王　燕(甘肅中醫(yī)學(xué)院　甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅　蘭州　73000)

脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/ CaM 信號(hào)通路關(guān)鍵分子動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律

段永強(qiáng)梁玉杰1成映霞1杜娟楊曉軼程衛(wèi)東2劉靚1高建德安耀榮1王燕1
(甘肅中醫(yī)學(xué)院甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730020)

〔摘要〕目的觀察脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子〔Ca2+〕i以及CaM、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平的變化。方法受試動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，脾虛模型7、14、21 d組，每組12只。除正常對(duì)照組外，其余受試動(dòng)物采用復(fù)合法(苦寒破氣法、游泳力竭法及饑飽失常法)成功建立脾氣虛證大鼠模型，在觀測(cè)各組大鼠一般生存狀態(tài)、胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能和骨骼肌組織ATP酶活性的基礎(chǔ)上，采用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)骨骼肌組織細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i濃度，蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ的表達(dá)變化。結(jié)果與空白組比較，脾氣虛大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，胃殘留率升高而小腸推進(jìn)率下降(P＜0.01) ;骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均降低(P＜0.05，P＜0.01) ;骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度和CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.01) ;且脾虛模型7 d、14 d、21 d組之間比較，以脾虛21 d組變化更為顯著。結(jié)論脾虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/CaM信號(hào)通路關(guān)鍵分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白以低表達(dá)為主。

〔關(guān)鍵詞〕脾氣虛證; Ca2+/CaM信號(hào)通路;骨骼肌

1甘肅中醫(yī)學(xué)院甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所

第一作者:段永強(qiáng)(1974-)，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中醫(yī)臨床基礎(chǔ)，中醫(yī)脾胃病的科研和臨床工作。

Expression changes of Ca2+/CaM signaling pathways key factors in skeletal muscle tissue of rats with spleen-qi deficiency

DUAN Yong-Qiang，LIANG Yu-Jie，CHENG Ying-Xia，et al.
Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of Gansu Province，Gansu College of TCM，Lanzhou 730020，Gansu，China

【Abstract】Objective To investigate the expression changes of Ca2+/CaM signaling pathways key factors〔Ca2+〕i，CaM，CaMKⅡand p-CaMKⅡin skeletal muscle tissue of rats with spleen-qi deficiency．Methods The rats were randomly divided into normal control，spleenqi deficient model groups(observed on 7 d，14 d and 21 d)，12 rats in each．The spleen-qi deficient model rats were made by rhubarb，exhaustive and hungry method，then general existence，gastric remnant rate，intestinal propulsion rates，and ATPase activity related to metabolism were evaluated．Also，confocal laser technology was used to test cellular〔Ca2+〕i concentration and Western blot was used to test CaM，CaMKⅡ，p-CaMKⅡexpressions in skeletal muscle of spleen asthenia rats．Results Compared with that of normal group，gastric remnant rate was increased and small intestinal propulsion rates were decreased(P＜0．01)，the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase were decreased significantly(P＜0．01，P＜0．05)，and the expressions of CaM，CaMKⅡ，p-CaMKⅡin skeletal muscle tissue were decreased，these differences were obvious on spleen-qi deficient model 21 d group(P＜0．01)．Conclusions The〔Ca2+〕i concentrations，CaM，CaMKⅡand p-CaMKⅡabnormaly decreased might be one of the pathological mechanisms of spleen-deficiency．

【Key words】Spleen-qi deficiency; Ca2+/CaM signaling pathways; Skeletal muscle

中醫(yī)認(rèn)為“脾主運(yùn)化”為氣血生化源，“脾氣散精”而將水谷精微輸布全身，內(nèi)至五臟六腑、外達(dá)四肢百骸，充養(yǎng)肌體，故有“脾主身之肌肉”之理論;如《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·藏氣法時(shí)論篇》云:“脾病者，身重，善饑肉痿，足不收行，善瘈，腳下痛。虛則腹?jié)M，腸鳴飧泄，食不化”，嚴(yán)重脾虛會(huì)導(dǎo)致氣血不足，肌肉失養(yǎng)而萎廢不用。本文在研究脾氣虛大鼠一般生存狀態(tài)、胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能和骨骼肌組織能量代謝相關(guān)酶活性的基礎(chǔ)上，觀察骨骼肌組織中Ca2+/CaM信號(hào)通路關(guān)鍵分子〔Ca2+〕i以及鈣調(diào)蛋白(CaM)、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、p-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)變化規(guī)律。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物3月齡SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～190 g，甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(甘) 2011-0001-0001011;實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào): SYXK(甘) 2011-0001-0000314。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處理的相關(guān)程序遵守中國(guó)國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(NHNRC)動(dòng)物道德準(zhǔn)則并得到了甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2藥物與試劑中藥均購(gòu)自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司。大黃、厚樸、枳實(shí)按2∶1∶1組成，以上方藥分別常規(guī)煎煮、去渣濾出藥液加熱濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后置4℃冰箱備用，使用時(shí)稀釋至所需濃度。

鈣鎂ATP酶試劑盒(Ca2+-Mg2+-ATPase，批號(hào)20130328)、鈉鉀ATP酶試劑盒(Na+-K+-ATPase，批號(hào)20130330)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所;考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)20130326)購(gòu)自南京建成生物工程研究所; Flou-3/AM鈣離子熒光染色劑(批號(hào)D00147366)購(gòu)自EMD Chemicals公司;抗CaM抗體、抗CaMKⅡ抗體、p-CaMKⅡ抗體(批號(hào)0002、0006)購(gòu)自Cell Singaling公司;內(nèi)參GAPDH(批號(hào)ZS-25778)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號(hào)ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋;磷酸酶抑制劑混合物(批號(hào)P1260)、BSA胎牛血清白蛋白(批號(hào)1213G052)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;總蛋白提取試劑盒(批號(hào)PC0020)、蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法，批號(hào)P1511)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;超敏發(fā)光液(批號(hào)090925)購(gòu)自bio world公司;氯仿，無(wú)水乙醇，異丙嗪，甲醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3主要儀器Biomate 3S超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher公司; Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、CFX96TM Optics Module PCR儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測(cè)定儀、Powerpac basic基礎(chǔ)電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司; KDC-2044低速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司; VT1000S震動(dòng)切片機(jī)，德國(guó)Leica公司; Fluoview FV1000激光共聚焦顯微鏡，日本O-lympus公司; VELOCITY 18R高速臺(tái)式低溫離心機(jī)，澳大利亞Dynamically公司; Hirayama HVE-50高壓滅菌器，日本Hirayama公司; P70D20P-TD(W0)微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2方法

1.2.1分組與造模48只SPF級(jí)Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按體重從小到大編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、脾虛模型組(7、14、21 d)，每組12只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。以苦寒破氣法(大黃、枳實(shí)、厚樸)、游泳力竭法及饑飽失常法三因素復(fù)合法復(fù)制脾氣虛證模型〔1，2〕: (1)苦寒破氣法:造模組大鼠每日上午按7.5 g/kg大黃枳實(shí)厚樸制劑液灌胃，1次/d。(2)游泳力竭法:每日下午2∶00使大鼠負(fù)重游泳，于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體重10％的保險(xiǎn)絲，放入水深50 cm、水溫20℃的水槽中游泳，并記錄大鼠游泳耐力時(shí)間，以游泳力竭(即大鼠鼻尖沒(méi)入水面10 s)為度，1次/d。(3)饑飽失常法:每日上午8∶00給予定量飼料，下午8∶00撤去飼料并稱(chēng)量剩余量，隔日再給予定量飼料，自由飲水。造模期間，正常對(duì)照組大鼠每日上午按1 ml/100 g體重灌服生理鹽水，并給予抓捏刺激，每日上午、下午各1次給予定量飼料，稱(chēng)量剩余量，自由飲水。

1.2.2標(biāo)本采集造模時(shí)分別于第7、14、21日取材并制備待檢樣本。各組大鼠于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，烏拉坦(1 g/kg)麻醉采血后斷頭處死并制備待檢標(biāo)本。血清制備:股動(dòng)脈取血4 ml，靜置2 h后2 000 r/min離心10 min，取上清，放入尖底管中4℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。骨骼肌組織的收集:動(dòng)物處死后，迅速將近股四頭肌組織截取于激光共聚焦檢測(cè)備用，另一部分骨骼肌組織置于用DEPC處理過(guò)的凍存管中，－80℃冷凍保存?zhèn)溆?，檢測(cè)CaM、CaMKⅡ相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.2.3各組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率測(cè)定胃排空率實(shí)驗(yàn)〔3〕:分別隨機(jī)抽取各組大鼠8只，禁食不禁水24 h后，給半固體營(yíng)養(yǎng)糊2 ml，30 min后用10％水合氯醛麻醉后股動(dòng)脈采血，制備待檢標(biāo)本。隨后迅速打開(kāi)腹腔，結(jié)扎幽門(mén)和賁門(mén)后取出胃，清除胃表面的血漬，第一次稱(chēng)重(胃總重)后剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分第二次稱(chēng)重(胃凈重)，胃排空率按公式計(jì)算:胃排空率=(胃總重－胃凈重)÷所給糊重×100％

小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)〔4〕:結(jié)扎幽門(mén)和回盲部，分離腸系膜，測(cè)量幽門(mén)至回盲部的長(zhǎng)度作為小腸總長(zhǎng)度，從幽門(mén)至營(yíng)養(yǎng)糊黑染的距離作為小腸推進(jìn)長(zhǎng)度。小腸推進(jìn)率按公式計(jì)算:小腸推進(jìn)率=營(yíng)養(yǎng)糊推進(jìn)距離(cm)÷小腸全長(zhǎng)(cm)×100％。

1.2.4各組大鼠骨骼肌組織中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性測(cè)定大鼠麻醉采血后迅速斷頭處死，低溫條件下快速取骨骼肌組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱(chēng)重后置于勻漿器中用9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，制成1％的骨骼肌組織勻漿液，后以3 500 r/min離心10 min，取上清液，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)法做蛋白定量，其余上清液置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性測(cè)定按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.2.5激光共聚焦檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞〔Ca2+〕i濃度將一部分骨骼肌組織快速冷凍后固定于盛有培養(yǎng)液的振蕩切片機(jī)后固定切片，切片厚度約200 μm，將切片用專(zhuān)用毛刷小心移入培養(yǎng)皿中，用PBS液沖洗骨骼肌組織切片2遍，加入10 μmol/L染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光溫育30 min。再將染色后的組織切片用PBS液沖洗三遍，加入1 ml含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液后置于20倍光學(xué)顯微鏡觀察區(qū)域及層面，用激光共聚焦顯微鏡觀察Flou-3AM染色的組織細(xì)胞的某一層面的熒光圖像;啟動(dòng)激光共聚焦顯微鏡，選擇488 nm氬離子激光采集〔Ca2+〕i熒光圖像并連續(xù)拍攝圖片后進(jìn)行掃描分析。

1.2.6蛋白免疫印跡檢測(cè)骨骼肌組織中CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)各組分別于造模7 d、12 d及21 d結(jié)束后麻醉處死并截取骨骼肌組織。用蛋白提取試劑盒(磷酸化蛋白檢測(cè)加入磷酸酶抑制劑)提取組織蛋白。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，以20 μg/道上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5％牛血清白蛋白封閉后分別加入一抗: 4℃搖床過(guò)夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，暗室曝光，顯影定影后用Bio-RAD Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件，組間樣本均數(shù)的比較選用F檢驗(yàn)，再用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠一般生存情況正常對(duì)照組大鼠始終表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏、活動(dòng)及飲食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。脾虛模型各組大鼠多數(shù)在第5天即開(kāi)始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯;第7天后出現(xiàn)怠動(dòng)少食、肛周污穢，甚至動(dòng)作遲緩;第14天后出現(xiàn)怠動(dòng)少食、消瘦弓背、肛周污穢，部分動(dòng)物出現(xiàn)脫肛、動(dòng)作遲緩，并逐漸出現(xiàn)體重減輕、大便稀軟呈橘黃色，而且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)上述癥狀表現(xiàn)突出;尤其在脾虛21 d組中，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠生存能力明顯下降，表現(xiàn)為怠動(dòng)少食、消瘦弓背、毛發(fā)枯槁疏散、肛周污穢，部分大鼠瞇眼蜷縮，反應(yīng)遲鈍，體重增長(zhǎng)明顯減緩。

2.2脾虛各組大鼠胃殘留率和小腸推進(jìn)率的比較與正常對(duì)照組比較，脾虛模型7 d組大鼠胃殘留率稍有降低趨勢(shì)，但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，脾虛模型14 d、21 d組大鼠胃殘留率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01) ;脾虛模型7 d、14 d組大鼠小腸推進(jìn)率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，而脾虛模型21 d組大鼠小腸推進(jìn)率顯著降低，與脾虛7 d組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1　脾虛各組大鼠胃殘留率和小腸推進(jìn)率的比較(±s，n=8，％)

表1　脾虛各組大鼠胃殘留率和小腸推進(jìn)率的比較(±s，n=8，％)

與正常對(duì)照組比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與脾虛模型7 d組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;下表同

組別　胃殘留率　小腸推進(jìn)率正常對(duì)照組脾虛模型7 d組脾虛模型14 d組脾虛模型21 d組41.93±6.50 39.20±4.94 45.70±5.663)51.85±7.472) 4)43.55±5.95 49.98±4.391)52.80±6.782)41.14±2.894)

2.3脾虛各組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的比較與正常對(duì)照組比較，脾虛模型7 d組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性有降低趨勢(shì)，但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，模型14 d、21 d組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性下降顯著(P＜0.01) ;與脾虛模型7 d組比較，模型21 d組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低更為顯著(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2　脾虛各組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較(±s，U/mg prot)

表2　脾虛各組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較(±s，U/mg prot)

組別　n　 Na+-K+-ATPase　 Ca2+-Mg2+-ATPase正常對(duì)照組脾虛模型7 d組脾虛模型14 d組脾虛模型21 d組10 10 98 1.94±0.28 1.80±0.22 1.58±0.171) 2)1.39±0.252) 4)0.47±0.09 0.46±0.07 0.38±0.092)0.31±0.082) 3)

2.4脾虛各組大鼠骨骼肌〔Ca2+〕i濃度的比較與正常對(duì)照組骨骼肌組〔Ca2+〕i熒光值(45.29±3.137)比較，脾虛模型7 d組、14 d大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度顯著降低，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(44.25±3.318，43.60±2.127，P＞0.05)，模型21 d組大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度顯著降低(41.70±2.904) (P＜0.05)，但各組模型間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1　脾虛各組大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度熒光圖

2.5脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)比較與正常對(duì)照組比較，脾虛模型7、14 d組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)，但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，脾虛模型21 d組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)量顯著降低，且與脾虛模型7 d組比較差異顯著(P＜0.05) ;而脾虛7 d組大鼠骨骼肌組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)，但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，脾虛模型14、21 d組大鼠骨骼肌組織p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)量顯著降低，且與脾虛模型7 d組比較差異顯著(P＜0.01)。見(jiàn)表3，圖2。

表3　脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)灰度值比較(±s，n=10)

表3　脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)灰度值比較(±s，n=10)

組別　CaM　CaMKⅡ　p-CaMKⅡ正常對(duì)照組脾虛模型7 d組脾虛模型14 d組脾虛模型21 d組0.34±0.033 0.33±0.041 0.31±0.042 0.28±0.0351) 3)0.53±0.037 0.53±0.049 0.51±0.053 0.46±0.0681) 3)0.62±0.031 0.60±0.041 0.52±0.0692) 4)0.51±0.0672) 4)

圖2　各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白免疫印跡表達(dá)圖

3　討論

脾氣虛證作為中醫(yī)臨床常見(jiàn)的臟腑疾病證候之一，主要以消化道功能障礙或減弱為主的全身性生理功能減弱的綜合臨床表現(xiàn)。中醫(yī)認(rèn)為“脾主運(yùn)化”，“脾氣散精”而將水谷精微輸布全身，內(nèi)至五臟六腑、外達(dá)四肢百骸，充養(yǎng)肌體，故有“脾主身之肌肉”之理論;脾主運(yùn)化即是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所指胃腸消化吸收功能，若有脾主運(yùn)化功能失調(diào)(即脾虛證)就會(huì)使消化吸收過(guò)程產(chǎn)生相應(yīng)的病癥，如納呆少食、嗜臥倦怠、四肢無(wú)力、便溏不調(diào)等，嚴(yán)重脾虛可導(dǎo)致機(jī)體神疲乏力、形體消瘦甚至肌肉萎廢不用等癥狀。本實(shí)驗(yàn)建立的脾氣虛模型癥候群與《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》〔5〕和《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》〔6〕描述的大鼠生理特點(diǎn)、《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》〔7〕以及總結(jié)近10年醫(yī)學(xué)期刊文獻(xiàn)資料建立的脾虛大鼠癥狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)〔8〕的依據(jù)相吻合。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，上述癥狀表現(xiàn)更加突出，在18 d后大鼠生存能力明顯下降。

中醫(yī)認(rèn)為“脾主運(yùn)化，胃主受納;脾以升為健，胃以降為和”，并以此概念概括脾胃消化吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)功能，所以脾胃升降運(yùn)動(dòng)包含著胃腸動(dòng)力的生理概念;脾胃虛弱，運(yùn)化無(wú)力，胃失和降，升降失常，是脾胃運(yùn)化功能失常的基本病理特點(diǎn)〔9〕。李志等〔10〕通過(guò)臨床研究證明脾虛患者胃半排空時(shí)間延長(zhǎng);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明脾虛大鼠存在胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能紊亂;廖志航等〔11〕通過(guò)研究大黃水煎液所復(fù)建的脾虛小鼠模型，結(jié)果顯示脾虛小鼠小腸墨汁推進(jìn)率升高，而胃排空實(shí)驗(yàn)提示胃排空時(shí)間縮短。本研究結(jié)果表明，在造模初期，受試大鼠胃腸排空時(shí)間縮短，可能與造模藥物大黃、枳實(shí)、厚樸有效組分興奮胃腸平滑肌有關(guān);隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，脾虛后期大鼠胃腸排空時(shí)間延長(zhǎng)，存在胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能紊亂，而在造模過(guò)程中出現(xiàn)小腸排空功能先興奮后抑制的動(dòng)態(tài)變化，可能與小腸消化間期移行性肌電復(fù)合波(MMC)、移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波(MMC)以及慢波頻率和快波頻率紊亂有關(guān)。

同時(shí)基于脾虛證的發(fā)生涉及消化、內(nèi)分泌、免疫、中樞神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等諸多系統(tǒng)功能紊亂的共識(shí)〔12〕，而這些系統(tǒng)生理功能的紊亂必然導(dǎo)致某些具體器官生理功能紊亂。故本研究選取反映組織器官基本生理功能的代謝相關(guān)酶Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性作為評(píng)判脾虛大鼠骨骼肌基本生理功能是否有變化。Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)亦稱(chēng)鈣泵，是衡量細(xì)胞線粒體功能和能量代謝水平的一個(gè)重要的指標(biāo)〔13〕。由于其活性依賴(lài)于ATP與Mg2+的結(jié)合，所以又稱(chēng)為Ca2+-Mg2+-ATPase，此酶能夠催化質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的ATP水解，釋放出能量，其活性降低可引起細(xì)胞離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及胞質(zhì)內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能異?！?4〕。位于細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATPase又稱(chēng)鈉泵，與ATP分解和細(xì)胞內(nèi)外鈉、鉀離子的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，對(duì)維持細(xì)胞能量代謝和生理功能具有重要作用〔15〕，如曾益宏等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)脾虛大鼠骨骼肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性均顯著降低。本實(shí)驗(yàn)條件下的研究結(jié)果表明，脾虛大鼠骨骼肌組織有關(guān)能量代謝相關(guān)酶的活性降低。

在Ca2+/CaM細(xì)胞信號(hào)通路中，CaM作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+受體可與Ca2+可逆性結(jié)合，進(jìn)一步可激活下游Ca2+-CaM依賴(lài)的蛋白激酶-CaMKⅡ而發(fā)揮生物學(xué)作用，而且CaM牽連許多細(xì)胞內(nèi)生理過(guò)程，包括調(diào)節(jié)骨骼肌、平滑肌的收縮和舒張〔17，18〕。在本實(shí)驗(yàn)條件下的研究結(jié)果表明脾虛模型大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度顯著降低，CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)量亦降低，其發(fā)生機(jī)制可能與在脾虛造模過(guò)程中，多因素造模法導(dǎo)致大鼠攝食量減少，物質(zhì)代謝降低以及便次增多(脾虛腹瀉)，血鈣濃度下降，從而使組織細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i濃度下降，并影響下游關(guān)鍵分子CaM、CaMKⅡ的表達(dá)以及p-CaMKⅡ的活化，故提示脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/CaM信號(hào)通路關(guān)鍵分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白以低表達(dá)為主，其中的深層次機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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〔2015-02-15修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160420) ;甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1010RJZA148) ;甘肅省教育廳基金項(xiàng)目(1006-05)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 15-4127-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.008