李冬秀，耿楊柳，吳小華，于曉惠，張　敏，徐清華，許鵬宇

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兩種玻璃化冷凍方法在大鼠卵巢組織冷凍中的應(yīng)用效果觀察

李冬秀，耿楊柳，吳小華，于曉惠，張敏，徐清華，許鵬宇

[摘要]目的比較直接覆蓋玻璃化冷凍(direct cover vitrification， DCV)及常規(guī)玻璃化冷凍(conventional vitrification, CV)在大鼠卵巢組織冷凍中的應(yīng)用效果。方法將雌性Wistar大鼠30只隨機分為A、B、C組，每組10只，切除大鼠雙側(cè)卵巢組織。A組為對照組，B組和C組分別應(yīng)用CV和DCV凍存2周。復(fù)蘇后觀察3組卵泡的形態(tài)，并用末端脫氧核酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸標記實驗(TUNEL)檢測各組卵泡的凋亡率。結(jié)果A組各級卵泡形態(tài)正常；B組卵泡形狀不規(guī)則，卵母細胞核固縮；C組較大的竇狀卵泡損傷。除C組原始卵泡外，B組和C組形態(tài)正常的各級卵泡比例均低于A組(P<0.05);C組形態(tài)正常的各級卵泡比例高于B組(P<0.05)。B、C組卵泡凋亡率高于A組，且C組低于B組(P<0.01)。結(jié)論DCV較CV卵巢組織效果更好，可以有效保存卵巢組織中的原始卵泡。

[關(guān)鍵詞]卵巢；玻璃化作用；低溫保存；大鼠,Wistar

隨著惡性腫瘤診斷技術(shù)的提高，女性惡性腫瘤患病率呈逐年年輕化趨勢，腫瘤治療后患者的生育力及內(nèi)分泌功能喪失[1]，放、化療后有近30%的患者因卵巢功能破壞而喪失生育能力[2]。另外，伴隨現(xiàn)代社會女性對事業(yè)和自身價值的追求及觀念的改變，越來越多的健康女性要求推遲生育年齡、保存生育能力，這些社會因素也給醫(yī)學(xué)界提出了新的挑戰(zhàn)。von Wolff等[3]的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在德國，有此需求的女性逐年增加，到2013年出現(xiàn)了迅猛增長趨勢。與胚胎和卵母細胞冷凍相比，卵巢組織冷凍兼具保存生育能力和內(nèi)分泌功能的優(yōu)勢，已成為人類生殖醫(yī)學(xué)和生殖工程研究的熱點。2004年Donnez等[4]通過腹腔鏡手術(shù)將凍存的卵巢組織自體原位移植成功，并使患者成功分娩，這一成果更加激發(fā)了后續(xù)研究者們的熱情。卵巢組織冷凍目前還沒有達成共識的方案，世界范圍內(nèi)通過卵巢組織冷凍方法出生的嬰兒也僅有20余例，卵巢組織冷凍移植的成功率及妊娠率仍較低[5]，亟待完善冷凍和移植方案。卵巢組織冷凍從慢速程序化冷凍到玻璃化冷凍均有成功案例，而玻璃化冷凍以其獨有的優(yōu)勢越來越趨于占主導(dǎo)地位。Chen等[6]對傳統(tǒng)的玻璃化冷凍方案進行了改良，首次報道了直接覆蓋玻璃化冷凍法(direct cover vitrification， DCV)，通過使小鼠卵巢組織與液氮直接接觸進行冷凍保存，降溫速率可達15 000℃/min，冷凍效果優(yōu)于傳統(tǒng)玻璃化冷凍。本研究擬比較常規(guī)玻璃化冷凍(conventional vitrification, CV)及DCV對大鼠卵巢組織的凍存效果，以期為更有效地保存人類卵巢組織提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組性成熟雌性Wistar大鼠30只(購自河北醫(yī)科大學(xué)動物研究中心)，8～10周齡，體重200～220 g，隨機分為A、B、C組，每組10只。A組(對照組)：取新鮮的大鼠卵巢組織進行后續(xù)研究；B組(CV組)：用CV法冷凍大鼠卵巢組織，凍存2周后復(fù)蘇進行后續(xù)研究；C組(DCV組)：用DCV法將大鼠卵巢組織冷凍，余同B組。本研究經(jīng)解放軍白求恩國際和平醫(yī)院倫理委員會批準，于該院動物實驗中心進行，該中心達到SPF條件。對動物處置符合科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求。

1.2實驗方法

1.2.1標本采集：每日對大鼠進行陰道涂片，通過觀察陰道脫落細胞類型推測動情周期，于大鼠動情期時取材。給予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，手術(shù)部位脫毛，完整切除大鼠雙側(cè)卵巢，用生理鹽水沖洗干凈，皮質(zhì)切為2 mm×2 mm×4 mm小塊，所有操作在冰盒上進行。A組卵巢組織皮質(zhì)切片直接甲醛固定；B、C組卵巢組織分別用CV和DCV法冷凍。

1.2.2玻璃化冷凍過程

1.2.2.1B組：將卵巢組織塊浸入平衡液[7.5%乙二醇(v/v)+7.5%二甲基亞砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，滲透平衡15 min，再移入冷凍液[15%乙二醇(v/v)+15%二甲基亞砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，繼續(xù)滲透平衡5 min。輕柔夾取小塊卵巢組織，置于1.8 ml的無菌冷凍管中，封蓋，投入液氮罐中儲存。

1.2.2.2C組：滲透平衡同B組，將卵巢組織放入無菌冷凍管中后，迅速浸入裝有無保存組織的液氮容器中，使之灌滿液氮，覆蓋卵巢組織后，蓋好冷凍管，投入液氮罐中儲存2周。

1.2.3復(fù)蘇過程:液氮保存2周后，取出冷凍管，37℃水浴中30 s，將卵巢組織塊依次移入解凍液a、b、c(分別為0.5、0.25、0.125 mol/L蔗糖+基礎(chǔ)液)中各5 min，再用含20%胎牛血清的DMEM沖洗卵巢組織2次，甲醛固定。

1.3觀察指標

1.3.1組織學(xué)觀察：石蠟包埋卵巢組織皮質(zhì)塊，5 μm連續(xù)切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察卵泡的形態(tài)、計數(shù)正常和異常形態(tài)的卵泡個數(shù)，并計算形態(tài)正常卵泡的百分比。形態(tài)正常的各級卵泡百分比=形態(tài)正常的各級卵泡個數(shù)/各級卵泡總個數(shù)×100%。為避免重復(fù)計數(shù)，卵泡計數(shù)以卵母細胞核為標記。各級卵泡形態(tài)的判定參照Gougeon[7]創(chuàng)建的標準。

1.3.2凍融卵巢組織凋亡情況：采用末端脫氧核酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸標記實驗(TUNEL)觀察新鮮、凍融后卵巢組織中卵母細胞DNA損傷情況。TUNEL試劑盒購自美國Roche公司，實驗按說明書進行。判定標準：陽性細胞定位于卵母細胞及顆粒細胞核，呈棕黃色。卵母細胞核呈陽性或>50%的顆粒細胞為陽性，認為該卵泡凋亡。卵泡凋亡率=卵泡凋亡數(shù)/總卵泡數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1組織形態(tài)學(xué)A組：新鮮卵巢組織間質(zhì)細胞排列緊密規(guī)律，間質(zhì)細胞將各級卵泡緊密地包裹在卵巢皮質(zhì)內(nèi)。各級卵泡形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，排列整齊、呈多層排列，基底膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見核濃縮。B組：卵巢組織間質(zhì)細胞分離明顯，卵泡形狀不規(guī)則，卵母細胞核固縮。C組：部分間質(zhì)細胞相互分離，原始卵泡形態(tài)保存較好，次級及竇狀卵泡可見損傷，顆粒細胞與基底膜部分分離，排列欠整齊。見圖1。除C組原始卵泡外，B組和C組形態(tài)正常的各級卵泡比例均低于A組(P<0.05);C組形態(tài)正常的各級卵泡比例高于B組(P<0.05)。見表1。

2.2細胞凋亡A、B、C組卵泡凋亡率分別為(8.54±1.17)%、(40.31±3.87)%、(18.28±2.48)%，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3組卵巢組織卵泡凋亡情況見圖2。

3討論

卵巢組織冷凍兼具保存女性生育力和內(nèi)分泌功能的獨特優(yōu)勢。卵母細胞冷凍和胚胎冷凍只適用于生育力保存,不能同時保留內(nèi)分泌功能，適應(yīng)人群局限，對未成年人及未婚女性來說無法實現(xiàn)，卵巢組織冷凍幾乎是青春期前女性保存生育力的最佳選擇。而卵巢組織冷凍移植既可以保存生育力，還兼具恢復(fù)女性內(nèi)分泌功能，不需要長時間的促排卵治療，是需要盡快治療的腫瘤患者的理想選擇，而且，有些雌激素依賴性腫瘤，病情本身不允許長時間促排卵治療[8]，以免加劇腫瘤的進展。卵巢皮質(zhì)中含有大量的原始卵泡及初級卵泡，這些未成熟的卵泡體積較小、未分化，無透明帶及顆粒細胞，代謝活動更少，更能耐受凍融保存[9]。

圖1　3組大鼠卵泡情況(HE×200)

圖2　3組卵巢組織卵泡凋亡情況

±s，%)

注：A組為對照組，B組為常規(guī)玻璃化冷凍組，C組為直接覆蓋玻璃化冷凍組；與A組同級卵泡比較，aP<0.05；與B組同級卵泡比較，cP<0.05

目前，全世界已有100多個生殖中心得到倫理委員會的支持，開展了卵巢組織冷凍這項技術(shù)[10]。常用的卵巢組織冷凍方法有慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍，程序化冷凍對卵巢組織基質(zhì)和血管內(nèi)皮均有損傷，但是也能保存卵泡[11]。與其相比，玻璃化冷凍技術(shù)能快速使組織及細胞形成“玻璃化”，避免冰晶形成，從而更好地保護各種細胞[12]。玻璃化冷凍方法在卵巢組織冷凍中的應(yīng)用可以更好保存卵泡活力，卵巢組織基質(zhì)和血管內(nèi)皮損傷均小于程序化冷凍[13]。DCV在對卵泡形態(tài)的保存方面明顯優(yōu)于CV，而且副損傷小于CV，這與其他報道是一致的[14]。本研究結(jié)果顯示，卵巢組織凍融后，次級卵泡和竇狀卵泡損傷率較高，而原始卵泡和初級卵泡損傷輕微，提示在冷凍及復(fù)蘇過程中體積越大的卵泡越不耐受冷凍，易發(fā)生副損傷。分析原因可能與較大的卵泡脫水不充分、代謝率偏高、含有較多顆粒細胞有關(guān)，而小的卵泡體積較小、未分化、代謝率低，周圍缺乏透明帶及顆粒細胞包裹，利于冷凍保護劑的滲透，因此小卵泡冷凍效果優(yōu)于大卵泡[15]。

大部分的原始卵泡及初級卵泡通過細胞凋亡逐漸走向閉鎖，并未發(fā)育為成熟卵泡，所以細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要途徑[16]。女性的卵巢組織中99.9%的卵泡都以凋亡的形式閉鎖[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮大鼠卵巢組織中卵泡的凋亡率為(8.54±1.17)%，低于Depalo等[18]和Rimin等[19]的報道，分析原因可能為細胞凋亡是一個瞬間的事件，而本研究所采用的TUNEL方法可能只能檢測出部分凋亡的細胞，或者卵泡在細胞凋亡之外還有其他的丟失途徑；取卵巢組織時所處的月經(jīng)周期不同也會影響細胞凋亡，本實驗于大鼠動情期取標本，此期卵泡的凋亡率較黃體期少[20]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)凍融后的卵巢組織中卵泡的凋亡率高于新鮮卵巢組織，說明凍融過程可誘發(fā)卵巢組織中卵泡凋亡的發(fā)生[19]。而Demirci等[21]發(fā)現(xiàn)卵巢組織凍融過程并不增加卵泡的凋亡。在本研究中，經(jīng)CV冷凍后卵泡的凋亡率較DCV高，說明改良的DCV可能是通過增加降溫速率，減少了卵泡的損傷，提高了冷凍效率，更適合于卵巢組織的冷凍保存。

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(收稿時間：2015-02-11修回時間：2015-03-17)

論著·

Comparison of Effects of Two Kinds of Vitrification Methods in Freezing Ovarian Tissues in Rats

LI Dong-xiu, GENG Yang-liu, WU Xiao-hua, YU Xiao-hui, ZHANG Min, XU Qing-hua, XU Peng-yu (Center of Reproductive Medicine Center, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo compare the effects of direct cover vitrification (DCV) and conventional vitrification (CV) in freezing ovarian tissues in rats. MethodsA total of 30 mature female Wistar rats were randomly divided into group A, B and C (n=10 for each group), and bilateral ovarian tissues of all rats were cut off. Group A was the control group; group B and C were respectively freezed using CV or DCV method for 2 weeks. After thawed, in the three groups, the follicular appearances were observed, and follicular apoptosis rates were detected using TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) method. ResultsThe appearances of each grade were normal in group A; the follicular appearances were irregular and oocyte karyopyknosis was found in group B; the bigger sinusoid ovarian follicles were damaged in group C. The normal rates of follicular appearances in all grades of group B and C were significantly lower than those in group A except for that of primordial follicles in group C (P<0.05); the normal ratios of follicular appearances in all grades of group B were significantly higher than those in group B (P<0.05). The follicular apoptosis rates in group B and C were significantly higher than that in group A, and the rate in group C was significantly lower than that in group B (P<0.01). ConclusionPrimordial follicles in the ovarian tissues can be better preserved by DCV than by CV.

[Key words]Ovary; Vitrification; Cryopreservation； Rats, Wistar

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.003

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R715；R-332A

[文章編號]2095-140X(2015)05-0009-04

[通訊作者]吳小華，E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金項目][作者單位]050082 石家莊,解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心