趙凌杰　邱艷　商瑋　劉春麗　趙智明　郭郡浩　蔡輝

姜黃素對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清骨保護(hù)素和核因子κ B受體活化因子配體蛋白表達(dá)及骨密度的影響

趙凌杰邱艷商瑋劉春麗趙智明郭郡浩蔡輝

【摘要】目的觀察姜黃素對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠血清骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)表達(dá)以及骨密度的影響，探討姜黃素防止類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rhuematoid arthritis，RA)骨破壞的作用機(jī)制。方法取SD大鼠30只，隨機(jī)分為模型組、姜黃素組及正常組，第28天腹主動脈取血，采用ELISA法來檢測血清中RANKL、OPG蛋白的表達(dá)，取血后處死大鼠，剝離大鼠右側(cè)脛骨，行骨密度檢查。結(jié)果(1)與正常組比較，造模組即模型組與姜黃素組大鼠血清RANKL均顯著升高(P<0.01)，血清OPG顯著降低(P<0.01)，RANKL/OPG比值顯著升高(P<0.01)；(2)與模型組比較，治療組即姜黃素組血清RANKL顯著降低(P<0.01)，血清OPG均顯著升高(P<0.01)，RANKL/OPG比值均顯著降低(P<0.01)；(3)3組大鼠脛骨整體骨密度無顯著性差異(P>0.05)，姜黃素組大鼠興趣區(qū)骨密度值顯著高于模型組(P<0.01)。結(jié)論姜黃素對AA大鼠具有良好的治療作用，能夠通過調(diào)節(jié)血清RANKL及OPG的表達(dá)，來調(diào)節(jié)OPG/RANKL通路，從而提高AA大鼠骨密度，抑制其骨丟失。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；佐劑性關(guān)節(jié)炎；骨密度；骨保護(hù)素；核因子κB受體活化因子配體

姜黃素(curcumin)是從植物姜黃根莖中分離出來的天然多酚類產(chǎn)物。近年來在體外和體內(nèi)對姜黃素進(jìn)行了廣泛的研究[1-2]，發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗腫瘤、抗病毒、抗關(guān)節(jié)炎、抗氧化等作用，其作用機(jī)制涉及到多個(gè)靶點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)錄因子如核因子κB(NF-κB)，生長因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素1( interleukin 1，IL-1)、IL-6，蛋白激酶如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和Akt，以及其他酶如環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)。由于其有效性，安全性及多目標(biāo)調(diào)控性，姜黃素成為一個(gè)潛在的治療及預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rhuematoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性疾病，以多關(guān)節(jié)滑膜炎為特征伴隨軟骨及骨破壞，引起關(guān)節(jié)畸形，甚至導(dǎo)致患者殘疾。且RA的發(fā)病率隨著環(huán)境及空氣的污染呈逐年增高的趨勢[3]。RA骨破壞包括局灶性炎癥活動部位的骨侵蝕和關(guān)節(jié)周圍的骨量減少，其機(jī)制并未被完全闡明，諸多證據(jù)表明RANK/RANKL通路是RA的骨質(zhì)流失的關(guān)鍵因素。RA動物模型支持RANK/RANKL系統(tǒng)在骨侵蝕中發(fā)揮作用，AA大鼠模型是最常見的RA動物模型，其造模方法簡單，成功率高[4]。本文通過觀察姜黃素對AA大鼠血清OPG、RANKL蛋白表達(dá)及骨密度的影響，進(jìn)一步探討其對RA的作用機(jī)制，為姜黃素治療RA提供動物實(shí)驗(yàn)參考。

1材料與試劑

1.1動物

雄性SD大鼠30只，清潔級，實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量140～160 g，(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動物中心供應(yīng)，使用許可證：SYXK20030032)。

1.2試劑

姜黃素溶液：濃度為5 mg/mL(將姜黃素500 mg溶解于無菌的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)10 mL，加無菌生理鹽水直至100 mL，用5 mL注射器進(jìn)行分裝，保存需要避光，冰箱溫度調(diào)節(jié)在-20 ℃，1周內(nèi)使用完，禁止反復(fù)凍融。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組及造模方法

將大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：正常組，模型組，姜黃素組，每組10只。用標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，飲水自由，將室溫控制在18～26℃之間，濕度調(diào)控在70%左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。除了正常組不造模，將其余2組大鼠左后跖處進(jìn)行常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑0.1 mL，制成AA模型，造模當(dāng)天記做第0天。

2.2給藥方法

模型組、姜黃素組，于第7天開始腹腔注射給藥。姜黃素組給予姜黃素溶液50 mg/kg·d，連續(xù)21天；模型組給予10% DMSO，5 mg/kg·d，連續(xù)21天；正常組自由飲水。于最后一次姜黃素治療后24小時(shí)，即第28天將大鼠仰臥位固定頭部、四肢，行腹主動脈取血，離心，取血清，低溫冰箱保存?zhèn)錂z，ELISA法檢測血清RANKL、OPG蛋白的表達(dá)；取血后處死大鼠，剝離大鼠右側(cè)脛骨，雙能X線骨密度儀(dual energy x-ray absorptiometry，DXA)測量大鼠脛骨骨密度記做整體骨密度，及脛骨遠(yuǎn)端1 cm處的興趣區(qū)域骨密度記為興趣區(qū)骨密度。

2.3檢測指標(biāo)和方法

2.3.1整體及興趣區(qū)骨密度處死大鼠后，剝離大鼠右側(cè)脛骨，取其標(biāo)本，用DXA進(jìn)行檢測，記錄整個(gè)脛骨的整體骨密度及興趣區(qū)骨密度。

2.3.2血清RANKL、OPG蛋白表達(dá)參考文獻(xiàn)[5]及試劑盒說明，離心機(jī)離心→取血清保存?zhèn)錂z→激活標(biāo)本→分別取OPG的ELISA試劑盒與RANKL的ELISA試劑盒→加入0.5 mL的蒸餾水混勻，配制成10 ng/mL溶液→標(biāo)準(zhǔn)管8管→第1管加入標(biāo)本稀釋液900 μL→第2至8管加入標(biāo)本稀釋液500 μL→在第1管中加入10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL混勻后加樣器吸出500 μL移至第2管→如此反復(fù)稀釋，從第7管中吸出500 μL棄去，第8管為空白對照組→洗滌液：用重蒸水1:20稀釋→加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后至37℃120分鐘→洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干→每孔加入第一抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后至37℃60分鐘→洗板：同前→每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后至37℃ 30分鐘→洗板：同前→每孔加入底物工作液100 μL，至37 ℃暗處15分鐘→每孔加入100 μL終止液混勻→30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在40 nm處測吸光值→結(jié)果計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62、31、15.6、0 pg/mL作為橫坐標(biāo)，光密度(optical density，OD)值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線→經(jīng)多元回歸計(jì)算結(jié)果。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3結(jié)果

注射完全弗氏佐劑后3～4小時(shí)，造模組所有大鼠左后足即可出現(xiàn)紅、腫的炎癥表現(xiàn)；第3天左右達(dá)到高峰；第7天左右4只足爪均有不同程度的腫脹，表明造模成功。本實(shí)驗(yàn)的造模成功率為100%。

3.13組大鼠骨密度的比較

3組大鼠右側(cè)脛骨整體骨密度之間比較均無顯著性差異(P>0.05)；模型組大鼠興趣區(qū)骨密度值顯著低于正常組大鼠興趣區(qū)骨密度(P<0.01)；姜黃素組大鼠興趣區(qū)骨密度值顯著高于模型組(P<0.01)。由此可見，大鼠造模后一定時(shí)間(28天)內(nèi)整體脛骨骨密度未出現(xiàn)顯著性降低。而造模組大鼠脛骨遠(yuǎn)端的骨密度出現(xiàn)顯著性降低，姜黃素的治療能顯著抑制AA骨密度下降，治療后骨密度與正常組無顯著性差異，詳見表1。

分組整體骨密度(g/cm2)興趣區(qū)骨密度(g/cm2)正常組 0.0709±0.00180.0701±0.0018模型組 0.0698±0.00090.0608±0.0012a姜黃素組0.0697±0.00140.0670±0.0008b

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3.23組大鼠血清RANKL、OPG及其比值的比較

由表2可見，大鼠血清RANKL，與正常組比較，模型組、姜黃素組均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，治療組即姜黃素組顯著降低(P<0.01)。大鼠血清OPG，與正常組比較，模型組、姜黃素組均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組顯著升高(P<0.01)。RANKL/OPG比值，與正常組大鼠比較，模型組、姜黃素組均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組顯著降低(P<0.01)。姜黃素能夠通過改變血清RANKL及OPG的表達(dá)，來改變其比值。

表2各組大鼠血清RANKL、OPG及其比值的比較

分組RANKLOPGRANKL/OPG正常組 34.41±0.6410.47±0.383.29±0.13模型組 54.21±0.53a6.63±0.24a8.19±0.28a姜黃素組47.57±0.46ab7.52±0.23ab6.33±0.20ab

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

4討論

RA這一病名是由英國人Garrod第一個(gè)提出的，發(fā)病后表現(xiàn)為小關(guān)節(jié)腫脹疼痛等炎癥癥狀，進(jìn)而出現(xiàn)受累部位骨丟失，隨著病情進(jìn)展，骨破壞加重，呈不可逆性，如未進(jìn)行正規(guī)治療，2年內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞可達(dá)到50%[6]。關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞是RA的重要病理特征，而局部的骨侵蝕又是RA患者關(guān)節(jié)畸形、功能障礙的最主要原因，因此早期預(yù)防及控制骨破壞是改變RA預(yù)后的關(guān)鍵。RA的骨破壞早期表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)軟骨及骨組織由病理組織取代，進(jìn)一步發(fā)展為軟骨及骨侵蝕，最終導(dǎo)致全身性的骨丟失，破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。

OPG/RANKL/RANK信號途徑是免疫系統(tǒng)紊亂疾病(包括RA)與骨破壞之間聯(lián)系的重要通路，破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)是參與骨破壞的主要細(xì)胞，而OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在OC分化成熟及活性保持中起著重要作用[7]。在正常的骨重建過程中，RANKL蛋白結(jié)合RANK，促使破骨細(xì)胞的生成，保持其活性，促進(jìn)骨的吸收功能。當(dāng)骨的吸收大于骨的形成時(shí)，成骨細(xì)胞系自動分泌更多的OPG，假性受體競爭結(jié)合RANKL，阻止RANKL與受體RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞生成、活化，抑制骨吸收功能，使骨吸收與骨形成又處于一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)[8]。而骨丟失是RA特征性標(biāo)志，其丟失程度與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用DXA檢查大鼠脛骨整體及興趣區(qū)的骨密度，通過骨密度來評價(jià)AA大鼠骨丟失情況。檢查測得大鼠骨密度的情況：造模后28天，所有組大鼠的整體骨密度差異無顯著性差異。由此可見，大鼠造模后一定時(shí)間(28天)內(nèi)整體脛骨骨密度并不會出現(xiàn)顯著降低。而脛骨遠(yuǎn)端1 cm的骨密度即興趣區(qū)骨密度，模型組興趣區(qū)的骨密度是顯著低于正常組的。而與模型組比較，藥物干預(yù)組即姜黃素組顯著升高。姜黃素，化學(xué)結(jié)構(gòu)為C21H20O6，研究發(fā)現(xiàn)其對免疫、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)作用，因此能夠產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。但姜黃素難以溶于水，易于溶于DMSO等有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)將姜黃素溶解于10%DMSO制成姜黃素溶液后，進(jìn)行藥物干預(yù)，目的是為了讓大鼠能夠更加好的吸收姜黃素，并且同時(shí)給予模型組大鼠腹腔注射10%的DMSO，以觀察姜黃素對AA大鼠的治療作用。本實(shí)驗(yàn)中觀察到在大鼠造模28天內(nèi)，脛骨遠(yuǎn)端存在著一定程度的骨丟失，姜黃素能夠抑制脛骨遠(yuǎn)端骨密度的降低。

研究表明[9-11]諸多炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-7、IL-17、IL-23、IL-34)能夠影響RA的炎癥及骨破壞，目前沒有有力的證據(jù)可以證明這些細(xì)胞因子能夠直接激活破骨細(xì)胞，但有證據(jù)表明絕大多數(shù)細(xì)胞因子是通過RANKL/RANK通路間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及活性，從而發(fā)揮作用。炎性細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)RANK，結(jié)合滑膜RANKL，來激活NF-κB或JNK，增強(qiáng)T細(xì)胞和DC的協(xié)同作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和增殖，最終導(dǎo)致軟骨及骨質(zhì)破壞。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法測得大鼠血清RANKL、OPG蛋白的表達(dá)，并計(jì)算出RANKL/OPG的比值。AA模型大鼠血清RANKL表達(dá)明顯增加，OPG的表達(dá)明顯減少，RANKL/OPG的比值明顯增加，骨密度檢查，興趣區(qū)的骨密度明顯低于其它組的大鼠，進(jìn)一步表明AA炎癥發(fā)生骨質(zhì)破壞重要通路為OPG/RANKL通路。姜黃素干預(yù)治療AA模型大鼠后，能降低血清的RANKL的表達(dá)，提高OPG的表達(dá)，最終RANKL/OPG的比值顯著均低于模型組。因此可見，姜黃素能夠影響到外周血清RANKL、OPG的含量，最終使得RANKL/OPG的比值顯著低于模型組。由此推測，在RA治療中，姜黃素通過調(diào)控RANKL/OPG的比值，來調(diào)節(jié)OPG/RANKL系統(tǒng)，從而參與到抑制RA骨丟失，防止RA骨破壞。

綜上所述，姜黃素對RA具有肯定的治療作用，通過降低血清RANKL表達(dá)，提高血清OPG的表達(dá)，降低RANKL/OPG的比值，維護(hù)RA骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡，有效預(yù)防骨質(zhì)破壞，防止關(guān)節(jié)損傷，提高其骨密度，改善RA的預(yù)后。姜黃素是傳統(tǒng)中藥的有效提取物，具有安全性較高，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步研究姜黃素，可能成為治療RA的重要藥物。

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(本文編輯：董歷華)

·論著·

作者單位：100853 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科

Effect of curcumin on the expression of blood serum osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-κB ligand protein and bone mineral density in adjuvant arthritis ratsZHAOLing-jie，QIUYan，SHANGWei，etal.DepartmentofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，Nanjing210002，China

【Abstract】ObjectiveBy observing the effects of curcumin on blood serum osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) protein and bone mineral density of adjuvant arthritis (AA) rat models, we try to explore the possible mechanism of curcumin preventing bone destruction in rheumatoid arthritis. Methods30 SD rats were randomly divided into model group, curcumin group and normal group. On day 28 draw blood from abdominal aorta to detect the expression of blood serum RANKL and OPG protein by ELISA method. After drawing blood, rats were sacrificed and stripped the right tibia, to examine bone density. Results(1) Compared with the normal group, the serum RANKL of model group and curcumin group rats were significantly increased (P< 0.01), the serum OPG expression were significantly decreased (P< 0.01), the ratio of RANKL/OPG were significantly increased (P< 0.01); (2) Compared with the model group, the serum RANKL of curcumin group was significantly decreased (P< 0.01), the serum OPG was significantly increased (P< 0.01), the ratio of RANKL/OPG was significantly decreased (P< 0.01); (3) There are no significant differences among the 3 groups’ tibia bone mineral density (P> 0.05). The bone mineral density in region of interest of curcumin group was significantly higher than that of the model group (P< 0.01). ConclusionsCurcumin has a good therapeutic effect on AA rats. Curcumin regulates the expression of blood serum RANKL and OPG, thus regulate the OPG/RANKL pathway, thereby improve bone mineral density in AA rats to inhibit the bone loss.

【Key words】Curcumin;Adjuvant arthritis;Bone mineral density;Osteoprotegerin;Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand

作者簡介：竇永起(1965- )，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤。E-mail:dyqi_301@yeah.net

(收稿日期：2014-05-14)

Corresponding author：ZHAO Ling-jie，Email：zhaolingjie68@163.com

【中圖分類號】R593.22

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.013