彭平 趙麗敏 劉斌 姜艷艷 馮朵 孫道涵 楊書娟 朱乃亮 石任兵

紅景天苷為中藥紅景天特性功效成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天苷及其苷元酪醇均具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管及其它臟器等作用［1-3］。為了解決基于紅景天苷的藥物開發(fā)資源問題，本課題組研究建立了基于堿轉(zhuǎn)化大孔吸附樹脂分離富集，由女貞子制備紅景天苷系列制備物的工藝方法與質(zhì)量控制體系，經(jīng)放大驗證工藝經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定簡便可行［4-9］，從而為基于紅景天苷的藥物創(chuàng)新提供了藥原支撐。目前已報道了諸多體內(nèi)外紅景天苷的含量測定方法，但對其代謝產(chǎn)物酪醇含量的同時測定方法只有超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)［10-11］，使得分析條件因儀器昂貴而受到一定的限制，鑒于此，筆者建立UPLC-PDA 同時測定制備物紅景天苷及酪醇體內(nèi)外含量的分析方法，并成功應(yīng)用于制備物質(zhì)量控制與藥物動力學(xué)表征及其類藥特性的系統(tǒng)研究，在研究中發(fā)現(xiàn)了制備物、紅景天苷與酪醇以及所構(gòu)建的有關(guān)藥物體系體內(nèi)表征特性，體現(xiàn)出藥物體系的三大基本特性:自然性、協(xié)同性、親和性［12-13］。研究結(jié)果為深入系統(tǒng)進(jìn)行制備物藥物研究奠定了基礎(chǔ)，同時亦為基于紅景天苷的藥物創(chuàng)新提供研究思路與分析方法學(xué)借鑒。

筆者擬陸續(xù)系統(tǒng)報道有關(guān)研究結(jié)果，本文首先報道所建立的UPLC-PDA 同時測定大鼠血清中制備物紅景天苷及酪醇的含量分析方法，與應(yīng)用于藥代動力學(xué)表征及其類藥特性的研究結(jié)果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀，PDA 檢測器，Empower 工作站，自動進(jìn)樣;Waters ACQUITY UPLC H-CLASS T3 色譜柱(50 mm ×2.1 mm，1.8 μm)，METTLER TOLEDO XS204(METTLER TOLEDO，瑞士)，METTLER TOLEDO XP26(METTLER TOLEDO，瑞士)，sigma 1-14 小型臺式離心機(jī)(sigma，德國)，Labconco ? CentriVap 離心濃縮儀(LABCONCO，美國)，渦旋混合器(其林貝爾，中國)，0.2 μm 微孔濾器。

1.2 藥品與試劑

紅景天苷對照品(北京方程生物科技有限公司，批號130426;含量99.9%)、水楊苷對照品(北京方程生物科技有限公司，生產(chǎn)批號121118;含量99.9%)、酪醇對照品(北京方程生物科技有限公司，批號120927;含量99.9%)、高氯酸(分析純，天津市鑫源化工有限公司)、色譜乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)、哇哈哈純凈水。

女貞子紅景天苷制備物:取女貞子藥材(浙江產(chǎn)地)70%乙醇提取，經(jīng)堿轉(zhuǎn)化后，大孔樹脂分離富集制備而得。(批次:20130926，由課題組制備，樣品經(jīng)高效液相色譜法測定，紅景天苷含量64.5%，酪醇含量0.2%)，

1.3 實驗動物

健康Sprague-Dawley(SD)，雌性，大鼠，體質(zhì)量200 ～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號:SCXK(京)2012-0001。

2 方法

2.1 女貞子紅景天苷制備物給藥方案與樣品采集

采用單次正常大鼠口服灌胃100 mg/kg 制備物(樣品中紅景天苷含量64.5%，酪醇含量0.2%)，并于給藥后2 分鐘、5 分鐘、10 分鐘、15 分鐘、30 分鐘、45 分鐘、1 小時、1.5 小時、2 小時、3 小時、4 小時、8 小時、12 小時、24 小時時間點(每時間點5 只大鼠)腹主動脈取血，每次5 mL，4000 r/min 離心10 分鐘，分離血清，即為含藥血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血樣處理方法

取300 μL 含藥血清，置于2 mL 離心管內(nèi)，準(zhǔn)確加入50 μL 質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)水楊苷溶液，渦旋30 秒，加0.4 mol/mL 高氯酸180 μL，渦旋30 秒，靜置15 分鐘，14800 r/min 高速離心15 分鐘，取上清液200 μL 加1 μL 50%NaOH 調(diào)pH 到6 ～7，過0.22 μm 微孔濾器，供UPLC-PDA 檢測分析。

2.3 體內(nèi)分析方法建立及液相色譜條件及系統(tǒng)適用性

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取紅景天苷、酪醇、水楊苷對照品各10 mg，分別置于10 mL 容量瓶中用流動相溶解并定容至10 mL，得質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的母液，用時用流動相稀釋至所需濃度。

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀，PDA 檢測器，Empower 工作站，ACQUITY UPLC H-CLASS T3色譜柱(50 mm ×2.1 mm，1.8 μm);流動相:乙腈-水(3 ︰97)，流速為0.3 mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣體積為10 μL，檢測波長276 nm。

血清中雜質(zhì)對成分測定無干擾，且紅景天苷、酪醇和水楊苷分離效果良好，具有較好的專屬性，分析條件可行，色譜圖見圖1。

圖1 空白血清和含藥血清UPLC 色譜對比圖

2.3.2 線性關(guān)系與靈敏度考察 取空白血清加入紅景天苷和酪醇混合對照品溶液，配制成紅景天苷濃度分別為1、5、10、25、50、100、200 μg/mL，酪醇濃度分別為0.5、1、5、10、25、50、100 μg/mL 的血清樣品，按血樣處理方法處理并測定，以紅景天苷或酪醇與內(nèi)標(biāo)濃度比(X)為橫坐標(biāo)，紅景天苷或酪醇與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。紅景天苷體內(nèi)濃度回歸方程為:Y =1.1958X-0.1421，R=0.9996(n=7)，線性范圍為1 ～200 μg/mL，酪醇體內(nèi)濃度回歸方程為:Y =2.6114X-0.0323，R =0.9996(n =7)，線性范圍為0.5 ～100 μg/mL。配制已知濃度的紅景天苷、酪醇對照品溶液測得方法最低檢測限(S/N =3)分別為0.5 μg/mL、0.25 μg/mL，最低定量限(S/N = 10)分別為1 μg/mL、0.5 μg/mL。

2.3.3 回收率與精密度考察 取空白血清加入紅景天苷和酪醇混合對照品溶液配制成低、中、高濃度血清樣品(紅景天苷質(zhì)量濃度分別為5、25、100 μg/mL，酪醇質(zhì)量濃度分別為1、10、50 μg/mL)各5 份，按血清處理方法處理測定，每一濃度進(jìn)行5份樣本分析，連續(xù)測定3 天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相對回收率(n=5)、絕對回收率(n =5)、日內(nèi)RSD(n =5)和日間RSD(n=3)，見表1。

表1 紅景天苷及酪醇體內(nèi)含量測定回收率與精密度考察結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取空白血清加入紅景天苷和酪醇混合對照品溶液，配制成低、中、高濃度的血清樣品(紅景天苷質(zhì)量濃度分別為5、25、100 μg/mL，酪醇質(zhì)量濃度分別為1、10、50 μg/mL)各3 份，一份于常溫(24℃)放置24 小時(測定時間為放置0、4、8、12、24 小時)，一份于-20 ℃放置30 天(測定時間為放置1、8、15、22、30 天)，一份于-80 ℃反復(fù)凍融5 次(測定時間為凍融次數(shù)1、2、3、4、5)，于相應(yīng)測定時間測定各血樣中紅景天苷和酪醇的濃度。結(jié)果表明紅景天苷和酪醇在-20℃放置及反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定性較好，見表2。

表2 紅景天苷及酪醇體內(nèi)含量測定穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=5)

3 結(jié)果

3.1 血藥濃度測定結(jié)果

取各組血清樣品制備測定，并計算口服制備物各時間點紅景天苷血藥濃度，結(jié)果見表3。在制備物血藥濃度檢測中，于0.5 小時、0.75 小時、1 小時時間點可檢測到酪醇的吸收峰，并計算血藥濃度分別約為0.30 ± 0.03 μg/mL、0.32 ± 0.04 μg/mL、0.21 ±0.03 μg/mL。

表3 紅景天苷制備物給藥后不同時間點紅景天苷的血藥濃度(μg/mL)

3.2 藥代動力學(xué)表征分析

采用生物學(xué)統(tǒng)計軟件PKSolver 計算得紅景天苷制備物大鼠體內(nèi)主要成分紅景天苷的藥代動力學(xué)參數(shù)，見表4，其體內(nèi)動態(tài)變化藥時曲線見圖2。

表4 制備物紅景天苷大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)

圖2 制備物紅景天苷大鼠體內(nèi)藥-時曲線

3.3 紅景天苷及酪醇體內(nèi)外含量相對比值分析

以紅景天苷含量為參比，計算體內(nèi)外制備物中成分酪醇含量與紅景天苷含量比值，即體外制備物成分含量比值為:酪醇︰紅景天苷;體內(nèi)成分血藥濃度比值為:酪醇︰紅景天苷，結(jié)果見表5。

表5 體內(nèi)外制備物紅景天苷與酪醇動態(tài)含量比值

結(jié)果顯示，以紅景天苷含量為參比，酪醇與紅景天苷含量比值排序為:制備物體外＜體內(nèi)0.5 小時＜體內(nèi)0.75 小時＜體內(nèi)1 小時;在大鼠體內(nèi)酪醇與紅景天苷含量比值較制備物增大了5.03 ～9.65倍，且從給藥后0.5 小時到1 小時持續(xù)了0.5 小時的增量動態(tài)變化。

4 討論

本研究建立了UPLC-PDA 同時測定大鼠血清中紅景天苷及酪醇的含量分析方法，并成功應(yīng)用于女貞子紅景天苷制備物藥代動力學(xué)表征及其類藥特性研究。研究發(fā)現(xiàn)女貞子紅景天苷制備物在正常大鼠體內(nèi)類藥成分主要以紅景天苷原型存在，其藥代動力學(xué)表征為:吸收快、生物利用度較高;而酪醇表征為體內(nèi)最大血藥濃度出現(xiàn)相對滯后，且與紅景天苷的血藥濃度比值較制備物成分含量比值呈明顯增高，并與紅景天苷具有部分共血藥與協(xié)同吸收時間。因此，酪醇的體內(nèi)表征及其來源是制備物中的微量酪醇在體內(nèi)以原型存在?還是制備物中紅景天苷由機(jī)體“有意”所為的代謝產(chǎn)物，而與紅景天苷構(gòu)成藥物體系，從而對其藥物屬性特性產(chǎn)生協(xié)同性?這引起課題組的高度關(guān)注，并系統(tǒng)探究其原委，揭示出其藥物體系基本表征特性。以制備物及其在正常大鼠體內(nèi)紅景天苷及酪醇含量、含量比值動態(tài)變化與藥代動力學(xué)表征關(guān)聯(lián)分析，揭示了女貞子紅景天苷制備物類藥特性，為對其進(jìn)行深入創(chuàng)新藥物研究奠定了基礎(chǔ)，同時亦為有關(guān)藥物研究提供了思考以及技術(shù)與方法學(xué)支撐。

正常狀態(tài)下大鼠女貞子紅景天苷制備物體內(nèi)藥代動力學(xué)表征研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)可同時存在紅景天苷和酪醇成分，但酪醇成分血藥濃度在正常狀態(tài)下僅達(dá)到檢測限，但在課題組系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，在有關(guān)病理模型狀態(tài)下大鼠體內(nèi)酪醇成分血藥濃度明顯增高，高出最低定量限，并應(yīng)用本分析方法成功研究了女貞子紅景天苷制備物的有關(guān)藥物體系及其藥物屬性與特性，有關(guān)實驗結(jié)果將進(jìn)一步報道。

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