陳 瑩,胡正海,胡本祥,沈 霞,顏永剛

(1 陜西中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西咸陽 712046;2 西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,西安 710069)

杭白芷根的分泌道超微結(jié)構(gòu)與其揮發(fā)油分泌的關(guān)系

陳 瑩1,胡正海2,胡本祥1,沈 霞1,顏永剛1

(1 陜西中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西咸陽 712046;2 西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,西安 710069)

利用光鏡及透射電子顯微鏡技術(shù)研究了杭白芷根中分泌道結(jié)構(gòu)及其揮發(fā)油的分泌,并重點(diǎn)探討分泌道中揮發(fā)油的分泌過程。結(jié)果顯示:(1)杭白芷的分泌道是由上皮細(xì)胞圍繞著的伸長的胞間隙,腔道內(nèi)貯存著揮發(fā)油。(2)分泌道細(xì)胞的質(zhì)體、細(xì)胞基質(zhì)以及線粒體參與揮發(fā)油或其前體物質(zhì)的合成。(3)在分泌道發(fā)育的后期,大量小泡與分泌細(xì)胞的液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜融合,將其內(nèi)的物質(zhì)釋放進(jìn)入空腔。研究認(rèn)為,杭白芷分泌道中揮發(fā)油主要合成部位為質(zhì)體及細(xì)胞基質(zhì),之后以擴(kuò)散滲透或通過膜質(zhì)小泡與液泡及質(zhì)膜融合這兩種方式分泌到空腔內(nèi),豐富的線粒體可能為這一系列過程提供能量。

杭白芷;發(fā)育;分泌道;揮發(fā)油;分泌

中藥白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosanaBoiss.Shan et Yuan]的干燥根[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,因初生根桿為芷,色白,故名白芷,是一種臨床常用的解表藥,在治療各種類型的疼痛癥狀中出現(xiàn)的頻率相當(dāng)高?，F(xiàn)代所用的白芷均為栽培品,以四川、河北、河南、浙江為四大歷史產(chǎn)區(qū)[2]。近年來有關(guān)白芷化學(xué)成分及藥理作用方面的研究已比較深入,以川白芷、杭白芷、祁白芷報道最多[2-4]。而其主要的入藥部位是根,其主要的藥用成分如揮發(fā)油、黃酮類等在根中產(chǎn)生,但其積累和分泌過程尚不清楚。雖然目前多數(shù)文獻(xiàn)報道杭白芷根中有分泌腔分布,杭白芷分泌結(jié)構(gòu)究竟是分泌道還是分泌腔？分泌結(jié)構(gòu)中揮發(fā)油究竟如何分泌？本研究通過透射電鏡技術(shù)對杭白芷根中分泌道的超微結(jié)構(gòu)以及發(fā)育過程中揮發(fā)油的分泌過程進(jìn)行了系統(tǒng)研究,以期為探討分泌道的超微結(jié)構(gòu)與揮發(fā)油分泌的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

分別于2012、2013年在陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥草園內(nèi),采集一年生和二年生杭白芷植株的根、莖、葉為試驗材料。

1.2 方 法

1.2.1 石蠟切片法和組織化學(xué)法 利用石蠟切片法對白芷不同營養(yǎng)器官在分泌道結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行觀察,取白芷不同部位(根、莖、葉)分割成0.5～1.0 cm長的片段,以FAA固定,常規(guī)石蠟切片,厚度5～10 μm,番紅-固綠染色,中性樹膠封片,Leica DMLB顯微鏡觀察并照相。利用蘇丹Ⅲ溶液進(jìn)行揮發(fā)油的組織化學(xué)定位,取新鮮的白芷根,制備徒手切片,切片厚度約50 μm,以蘇丹Ⅲ溶液染色后稍加熱,然后用稀甘油處理,Cx21Fs1型(日本OLYMPUS)顯微鏡觀察并照相。

1.2.2 半薄切片法 利用半薄切片法對白芷根中分泌道進(jìn)行觀察,取不同發(fā)育時期的杭白芷的根,分割成0.5×0.5×1 mm的小塊,固定于4%戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制,pH 7.2)中,低溫4 ℃固定,過夜,緩沖液沖洗,1%鋨酸室溫后固定2 h,緩沖液沖洗,系列酒精脫水,環(huán)氧丙烷過渡,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,Reichert-Jung切片,切片厚1～2 μm,TBO染色[5],Leica DMLB顯微鏡觀察并照相。

1.2.3 超薄切片法 上述材料Leica EM UC6切片機(jī)切片,切片厚70～90 nm,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,H-7650(Hitachi,Japan)透射電鏡下觀察分泌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并照相。

2 觀察結(jié)果

2.1 杭白芷分泌道的光鏡結(jié)構(gòu)及分布

杭白芷的分泌道是由分泌細(xì)胞圍繞著的伸長的胞間隙(圖版Ⅰ,1、2),腔道內(nèi)貯存著揮發(fā)油(圖版Ⅰ,3)。在杭白芷根、莖、葉中均有分泌道存在。在根中,分泌道主要分布在中柱鞘薄壁組織和次生韌皮部中(圖版Ⅰ,4);在莖中,主要存在于皮層和髓中(圖版Ⅰ,5、6);在葉中,主要存在于葉脈薄壁組織中(圖版Ⅰ,7)。杭白芷根的初生結(jié)構(gòu)無分泌道(圖版Ⅰ,8),因此杭白芷根中分泌道屬于次生分泌道,而莖中分泌道主要分布于皮層和髓中,且多存在于木質(zhì)部和韌皮部相對處,在葉中分泌道分布在維管束的上、下組織中,這些分泌道均屬初生分泌道。

2.2 分泌道的超微結(jié)構(gòu)觀察

杭白芷中成熟的分泌道是由一層分泌細(xì)胞和空腔所構(gòu)成,周圍沒有鞘細(xì)胞。早期分泌細(xì)胞與周圍細(xì)胞的差別不大,體積較小。隨后分泌細(xì)胞細(xì)胞壁之間逐漸相互分離,形成空腔(圖版Ⅱ,1)。此時分泌細(xì)胞仍具有明顯的細(xì)胞學(xué)特征:細(xì)胞質(zhì)濃厚,具小液泡,同時具有明顯的細(xì)胞核,細(xì)胞壁薄,質(zhì)體豐富且質(zhì)體中含有高電子密度物質(zhì)(圖版Ⅱ,1、2)。之后空腔逐漸擴(kuò)大,分泌細(xì)胞也發(fā)生改變,小液泡逐漸融合形成較大液泡,有明顯的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及質(zhì)體(圖版Ⅱ,3、4),質(zhì)體中有灰黑色的嗜鋨滴(圖版Ⅱ,4),同時,高電子密度物質(zhì)也出現(xiàn)在空腔和液泡中(圖版Ⅱ,5、6)。同時,在質(zhì)體中嗜鋨滴附近出現(xiàn)膜系統(tǒng)降解的類囊膜鞘結(jié)構(gòu),質(zhì)體周圍出現(xiàn)大量高電子密度黑色團(tuán)塊(圖版Ⅱ,7),液泡內(nèi)一些嗜鋨滴周圍也圍繞著大量黑色團(tuán)塊(圖版Ⅱ,8),與質(zhì)體周圍的高電子密度物質(zhì)類似(圖版Ⅲ,1)。隨著分泌道擴(kuò)大,大液泡不斷增大,占據(jù)了細(xì)胞的大部分,細(xì)胞核、質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均可見(圖版Ⅲ,2～5),在空腔內(nèi)和液泡內(nèi)進(jìn)一步積累大量高電子密度物質(zhì)(圖版Ⅲ,2、3),同時液泡內(nèi)出現(xiàn)同心環(huán)狀的膜結(jié)構(gòu),包圍著黑色團(tuán)塊(圖版Ⅲ,6),液泡周圍存在大量線粒體(圖版Ⅲ,7)。隨后,在空腔及液泡周圍出現(xiàn)大量由膜包被的黑色團(tuán)塊物質(zhì)(圖版Ⅲ,8;圖版Ⅳ,1),并且這些膜質(zhì)小泡與液泡膜和質(zhì)膜逐漸融合并釋放其內(nèi)容物(圖版Ⅳ,2～4)。進(jìn)入成熟期,成熟的分泌道是由一層分泌細(xì)胞構(gòu)成,沒有鞘細(xì)胞,此時各細(xì)胞器已被大液泡擠到緊貼質(zhì)膜的位置,細(xì)胞器的數(shù)量也減少直至消失。到分泌道發(fā)育的后期,小泡內(nèi)的物質(zhì)減少并與質(zhì)膜開始融合(圖版Ⅳ,5),同時分泌細(xì)胞中細(xì)胞器數(shù)量減少,質(zhì)體、高爾基體被大液泡擠到質(zhì)膜附近(圖版Ⅳ,4、6、7),細(xì)胞核出現(xiàn)內(nèi)折現(xiàn)象(圖版Ⅳ,8)。

3 討 論

大量文獻(xiàn)中報道白芷根中存在分泌腔或油室,根據(jù)本實(shí)驗從杭白芷根的縱切面上來看,其分泌結(jié)構(gòu)呈長管狀,應(yīng)屬于分泌道。整個發(fā)育過程中沒有觀察到細(xì)胞破毀,空腔形成是由分泌細(xì)胞細(xì)胞壁之間逐漸相互分離而來的,因此,白芷根中分泌道應(yīng)屬于裂生型,與Fahn[6]對傘形科分泌組織的描述一致。而超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明,分泌道與揮發(fā)油合成和分泌存在密切關(guān)系。精油的生化研究表明,它是植物次生代謝產(chǎn)物,主要是含有揮發(fā)性的分子量小的萜類物質(zhì)成分[6],分為單萜、倍半萜、二萜等幾類。單萜是由單萜合成酶或環(huán)化酶催化牦牛兒苗基二磷酸(GPP)的合成反應(yīng)而來的,眾多的研究均表明質(zhì)體是其專一性的合成部位[7]。由于倍半萜合成酶位于細(xì)胞質(zhì)中,其性質(zhì)與單萜合成酶相似。因而FPP及倍半萜的合成,一般認(rèn)為是在細(xì)胞溶質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞溶質(zhì)的交界面處[8-9]。二萜合成酶的基本性質(zhì)與單萜和倍半萜合成酶性質(zhì)相似,合成也在質(zhì)體上[7]。結(jié)合本實(shí)驗在杭白芷中的觀察結(jié)果,在分泌道發(fā)育過程中,嗜鋨滴及黑色團(tuán)塊物主要分布在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì),因此,精油的主要合成部位為質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)。這些觀察與生化合成的研究結(jié)果是基本一致的,同時,在上述精油合成、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中,有大量線粒體存在,豐富的線粒體可能為這一系列過程提供能量,同時看到大量膜質(zhì)小泡包裹黑色團(tuán)塊物質(zhì)并與液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜融合,說明膜質(zhì)小泡與精油分泌的關(guān)系密切,而且在分泌細(xì)胞內(nèi)可見高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解形成的同心環(huán)狀膜結(jié)構(gòu),說明高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也可能參與了膜質(zhì)小泡的形成,幫助細(xì)胞完成轉(zhuǎn)運(yùn)過程。杭白芷根中分泌道的分泌細(xì)胞中精油主要合成部位是質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì),之后以擴(kuò)散滲透或通過膜質(zhì)小泡與液泡及質(zhì)膜融合這兩種方式分泌到空腔內(nèi),類似的結(jié)果在蔡霞等[10]對北柴胡分泌道中揮發(fā)油分泌的研究也有報道,這為探討傘形科植物精油合成場所和轉(zhuǎn)運(yùn)提供了更多的細(xì)胞學(xué)證據(jù),生化途徑和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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圖版說明:

SC.分泌道;SP.次生韌皮部;SX:次生木質(zhì)部;VB.維管束;Ph.韌皮部;X.木質(zhì)部;E.表皮;C.皮層;CC.中柱;L.空腔;M.線粒體;N.細(xì)胞核;P.質(zhì)體;V.液泡;Ms.類囊膜鞘結(jié)構(gòu);G.高爾基體

Explanation of plates:

SC.Secretory canals;SP.Secondary phloem;SX.Secondary xylem;VB.Vascular bundles;Ph.Phloem;X.Xylem;E.Epiderm;C.Cortex;CC.Central cylinder;L.Lumen;M.Mitochondria;N.Nucleolus;P.Plastid;V.Vacuole;MS.Myelin-like structures;G.Golgi apparatus

圖版 Ⅰ 1.白芷根縱切,×400;2.白芷根橫切,×400;3.白芷根橫切,蘇丹Ⅲ染色,×100;4.白芷根橫切,示次生結(jié)構(gòu),×100;5.白芷莖橫切,示莖初生結(jié)構(gòu),×100;6.白芷莖橫切,示維管束×400;7.葉橫切,示葉片結(jié)構(gòu),×400;8.根尖橫切,示根的初生結(jié)構(gòu),×400。

Plate Ⅰ

Fig.1.Longitudinal section of the root,×400;

Fig.2.Cross section of the root,×400;

Fig.3.Cross section of the root staining with Sultan Ⅲ,×100;

Fig.4.Cross section of the root showing secondary structure,×100;

Fig.5.Cross section of the stem showing primary structure,×100;

Fig.6.Cross section of the stem showing vascular bundle,×400;

Fig.7.Cross section of the leaf showing primary structure,×400;

Fig.8.Cross section of the root tip showing primary structure,×400.

圖版 Ⅱ 1.分泌道早期;2.分泌細(xì)胞,示細(xì)胞核;3.分泌道,示空腔形成;4.分泌細(xì)胞,示各細(xì)胞器;5.空腔中出現(xiàn)高電子密度物質(zhì);6.液泡中出現(xiàn)同心環(huán)狀膜結(jié)構(gòu);7.質(zhì)體中出現(xiàn)類囊膜鞘結(jié)構(gòu);8.液泡中出現(xiàn)黑色團(tuán)塊物。

Plate Ⅱ

Fig.1.TEM micrographs of secretory initial cells;

Fig.2.Secretory cells,showing nucleolus;

Fig.3.A developing secretory canal,showing lumen;

Fig.4.Secretory cells,showing mitochondria,plastid;

Fig.5.Part of a secretory cells,showing osmiophilic droplet in lumen;

Fig.6.Part of a secretory cells,showing vacuole with concentric ring structure;

Fig.7.Plastid which have myelin-like structures;

Fig.8.Vacuole which have diffusion-shaped black masses which instruct with the five-pointed star.

圖版 Ⅲ 1.膜質(zhì)小泡;2.空腔中積累大量高電子密度物質(zhì),示細(xì)胞核;3～5.各細(xì)胞器,線粒體、質(zhì)體及高爾基體;6.同心環(huán)狀結(jié)構(gòu);7.大液泡將細(xì)胞器擠向一側(cè);8.膜質(zhì)小泡。

Plate Ⅲ

Fig.1.Vesicles in cytoplasm;

Fig.2.Showing the lumen with numerous osmiophilic droplets;

Fig.3-5.Secretory cells,showing mitochondria,plastid,dictyosome;

Fig.6.Concentric ring structure in vacuole;

Fig.7.Part of a developing secretory canal,showing a large center vacuole in a secretory cell;

Fig.8.Vesicles in vacuole.

圖版 Ⅳ 1.空腔中出現(xiàn)膜質(zhì)小泡;2.膜質(zhì)小泡釋放內(nèi)容物;3.膜質(zhì)小泡與液泡膜融合;4.膜質(zhì)小泡內(nèi)容物減少;5.不規(guī)則的膜質(zhì)小泡;6.細(xì)胞器緊貼質(zhì)膜;7.高爾基體;8.細(xì)胞核內(nèi)折。

Plate Ⅳ

Fig.1.Vesicles in lumen;

Fig.2.Vesicles releasing content;

Fig.3.The fusion of vesicles with vacuole membrane;

Fig.4.Vesicle which have decreasing content;

Fig.5.Vesicles becoming irrugular;

Fig.6.Close to the plasma membrane organelles;

Fig.7.Showing the golgi apparatus nearing cell wall;

Fig.8.Showing the folded nucleus.

(編輯:潘新社)

Relationship between Ultrastructure and Secretion ofSecretory Canals in Root ofAngelicadahurica

CHEN Ying1,HU Zhenghai2,HU Benxiang1,SHEN Xia1,YAN Yonggang1

(1 College of Pharmacy,Shaanxi-University of Chinese Medicine,Xianyang,Shaanxi 712046,China;2 Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Westen China,Ministry of Education,Northwest Unicersity,Xi’an 710069,China)

The ultrastructure of secretory canals in root ofAngelicadahuricaand the accumulation of essential oils were investigated by transmission electron microscopy (TEM) analysis.The secretion process of the essential oil was also discussed.The results indicate that the plastid,ground substances of cytoplasm and mitochondria took part in the biosynthesis of oil or oil precursor.At latter stages of development of secretory cells,numerous different sized vesicles fused with the plasmalemma and tonoplast and released the inner materia into the lumen of secretory canals.As a result,plastid and ground substances of cytoplasm were the major synthetic site of volatile oil which secreted into the lumen by diffusion or by vesicles fusing with the plasmalemma and tonoplast.Abundant mitochondria may provide energy for the series of process.

Angelicadahurica;development;secretory canal;essential oil;secretion

1000-4025(2015)04-0716-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0716

2014-08-30;修改稿收到日期:2015-01-19

國家自然科學(xué)基金(81102758);陜西省自然科學(xué)基金(2013JQ4012)

陳 瑩(1981-),女,博士,講師,主要從事藥用植物結(jié)構(gòu)發(fā)育研究。E-mail:chenying029@163.com

Q944.5

A