王鴻蕉，張麗萍，劉志強(qiáng)，劉旦梅，金竹萍，裴雁曦

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原030006）

繼一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）之后，硫化氫（H2S）被確認(rèn)為生物體內(nèi)第3種氣體信號分子，成為近年來的一個研究熱點(diǎn)［1］。植物內(nèi)源H2S 是以半胱氨酸（Cys）為底物，由半胱氨酸脫巰基酶（cysteine desulfhydrases，CDes）催化產(chǎn)生［2］。目前植物中主要研究的CDes包括以L－Cys為底物的LCD、DES［3］，和以D－Cys為底物的DCD［1］。已有研究表明，H2S參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的多種過程，如促進(jìn)種子萌發(fā)、根形態(tài)建成、葉綠素含量增加、花期調(diào)節(jié)等［4－6］。此外，H2S在植物響應(yīng)各種非生物脅迫中也發(fā)揮了重要作用。它可以調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽、高熱的耐受性［7－9］，緩解由銅脅迫引起的小麥種子萌發(fā)抑制［10］；通過與Ca2＋的協(xié)同作用提高谷子對Cr6＋的耐受性［11］；緩解氧化脅迫引起的豌豆根尖細(xì)胞死亡［12］。

低溫脅迫分為0℃以上的冷害和0℃以下的凍害。低溫可造成植株生長發(fā)育減緩、組織丙二醛（MDA）和H2O2含量升高，以及光合作用的抑制［13］，并誘發(fā)棉花葉片衰老［14］。光合作用是植物將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的過程，光粒子的捕捉和電子傳遞是光合作用重要的過程，與此相關(guān)的基因的表達(dá)量直接影響光合作用的強(qiáng)弱。LHCB 基因編碼捕光蛋白，LHCB2．1突變使擬南芥葉綠素含量顯著降低［15］。鐵氧還蛋白（Fd）是高等植物光合系統(tǒng)Ⅰ中一類獨(dú)特的受體，擬南芥Fd 基因突變后可導(dǎo)致光合速率明顯降低［16］。硫氧還蛋白（Trx）定位于葉綠體［17］，能夠激活果糖－1，6－二磷酸酶和NADH－蘋果酸脫氫酶［18］，對碳的同化起重要作用。白菜是中國北方重要蔬菜作物，低溫脅迫會對白菜生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。目前植物對低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制的深入研究還很有限。本實驗希望通過研究生理濃度H2S對低溫下白菜幼苗生長和光合作用的影響，從新的角度加深對植物響應(yīng)冷脅迫生理機(jī)制的理解。

1 材料和方法

1．1 材料培養(yǎng)及處理

實驗材料為‘津育75號’白菜，選擇均勻飽滿的種子，種植在土、珍珠巖、蛭石（體積比1∶1∶1）組成的混合基質(zhì)中，于正常生長條件下培養(yǎng)：溫度23℃，相對濕度60%，光照度3 000lx，光周期16／8h（晝／夜），10d后開始對白菜幼苗進(jìn)行低溫處理。

4 ℃處理0d的白菜幼苗在23 ℃生長13d，低溫處理3d的幼苗于第11天置于4 ℃開始處理，測定CDes編碼基因的表達(dá)水平及H2S產(chǎn)率。

在外源H2S對冷脅迫下白菜幼苗生長及光合作用影響的實驗中，處理分6組。第11天 時將各組幼苗置于同等體積的密閉玻璃罩內(nèi)，其中的第2、4組用5μmol·L－1硫氫化鈉（NaHS）水溶液進(jìn)行熏蒸處理24h，第12天將幼苗取出。其中的第5、6組用1 mmol·L－1的H2S 合成抑制劑羥胺（hydroxylamine，NH2OH）處理4h；之后將第3、4、5組共同置于4 ℃下處理3d，其余各組培養(yǎng)溫度為23℃。即第1～6組分別為對照（CK，未做任何處理）、硫化氫處理（H2S，僅作NaHS熏蒸處理）、低溫處理（4 ℃，僅 作4 ℃低 溫 處 理）、硫 化 氫 和 低 溫 處 理（H2S＋4 ℃，NaHS熏蒸后進(jìn)行4 ℃低溫處理）、羥胺和低溫處理（HA＋4 ℃，NH2OH 處理4h后再進(jìn)行4 ℃低溫處理）、羥胺處理（HA，僅NH2OH 處理4h）。

1．2 生理指標(biāo)的測定

相對含水量采用飽和含水量法檢測［19］。H2S產(chǎn)率的測定參照J(rèn)in方法［8］。采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量［20］，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法［21］，葉綠素含量的測定參考Chen方法并加以修改［5］。幼苗氣體交換參數(shù)凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間二氧化碳濃度（Ci）使用CB－1102便攜式光合蒸騰儀（北京雅欣理儀科技有限公司）進(jìn)行檢測，測定時需光源充足且穩(wěn)定，空氣中CO2含量穩(wěn)定。氣孔開度觀察方法參考Jin等［8］方法，使用Olympus BX 51顯微鏡進(jìn)行觀察。

1．3 基因表達(dá)檢測

白菜幼苗總RNA 提取及基因表達(dá)檢測參考Jin等［8］方法，用Bio－Rad CFX96熒光定量PCR 儀進(jìn)行Real－time PCR 檢 測，數(shù) 據(jù) 采 集 與 分 析 使 用IQ5軟件。

1．4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用STATISTICA（Stat Soft Inc，Tulsa，OK）軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用Mean＋SE表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 冷脅迫對白菜幼苗H2S合成相關(guān)基因及內(nèi)源H2S產(chǎn)率的影響

LCD、DCD、DES 是植物體內(nèi)產(chǎn)生H2S最主要的3個脫巰基酶編碼基因，白菜幼苗在4 ℃低溫處理3d后這3種基因的表達(dá)水平與未進(jìn)行低溫處理的對照組相比都極顯著上調(diào)（圖1，A），內(nèi)源H2S產(chǎn)率也極顯著升高（圖1，B），即在受到低溫脅迫時伴隨著白菜幼苗體內(nèi)H2S 含量升高，表明H2S 可能參與了白菜響應(yīng)低溫的過程。

2．2 外源H2S對冷脅迫下白菜幼苗生長的影響

圖1 冷脅迫對白菜幼苗半胱氨酸脫巰基酶基因（CDes）表達(dá)量和H2S產(chǎn)率的影響＊＊表示冷脅迫前（0d）和脅迫3d在0．01水平存在顯著性差異Fig．1 The changes of cysteine desulfhydrases coding genes（CDes）expression and H2S production rate in cabbage seedlings under chilling stress＊＊stand for significant difference between chilling stresses for 0dand 3dat 0．01level

圖2 H2S對冷脅迫下白菜幼苗生長狀況的影響不同小寫字母表示各處理組間在0．05水平存在顯著性差異；下同F(xiàn)ig．2 Influence of H2S on cabbage seedlings growth status under chilling stress The different letters indicated significant difference among treatments at 0．05level；The same as below

為進(jìn)一步研究H2S在植物抵御冷脅迫中的作用，用5μmol·L－1NaHS和1mmol·L－1H2S合成抑制劑羥胺（HA）對白菜幼苗進(jìn)行預(yù)處理，觀察冷脅迫對其生長狀態(tài)的影響。圖2 顯示，與對照（CK）相比，4 ℃處理（4 ℃）的白菜幼苗長勢相對弱小（圖2，A），其地上部高度、葉寬和葉片相對含水量顯著降低，而NaHS預(yù)處理（H2S）和NH2OH 處理預(yù)處理（HA）的白菜幼苗的生長則在一定程度上得到促進(jìn)，但其地上部高度、葉寬和葉片相對含水量則無顯著變化（圖2，B～D）。與4 ℃處理相比較，HA預(yù)處理后再經(jīng)4 ℃處理（HA＋4 ℃）的白菜幼苗長勢明顯弱于單獨(dú)低溫處理組（4 ℃）和H2S 預(yù)處理后冷脅迫處理組（H2S＋4 ℃）（圖2，A），且其地上部高度、葉寬和葉片相對含水量顯著降低（圖2，B～D）；H2S預(yù)處理后冷脅迫下（H2S＋4 ℃）的幼苗長勢較4 ℃處理稍有促進(jìn)（圖2，A），且其上述3個指標(biāo)均顯著提高；H2S＋4 ℃的白菜幼苗長勢明顯強(qiáng)于HA＋4 ℃處理，其3個生長指標(biāo)也均顯著大于HA＋4 ℃處理（圖2，B～D）。可見，常溫條件下，H2S和HA 預(yù)處理對白菜幼苗生長沒有顯著影響；4 ℃冷脅迫顯著抑制了白菜幼苗的生長，施加外源H2S可以顯著促進(jìn)低溫下白菜幼苗的生長，即H2S在白菜幼苗抵抗冷脅迫過程中發(fā)揮重要作用，施用外源H2S能有效緩解冷脅迫對白菜幼苗生長造成的抑制。

2．3 外源H2S對冷脅迫下白菜幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的影響

受到低溫脅迫后，植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖含量會升高［22］。與CK 相比較，白菜幼苗葉片脯氨酸含量在H2S和HA 處理均有所降低，但未達(dá)到顯著水平，而4 ℃、H2S＋4 ℃、HA＋4 ℃處理下均顯著提高；與4 ℃冷脅迫相比，葉片的脯氨酸含量在H2S＋4 ℃處理下顯著提高，而在HA＋4 ℃處理下無顯著變化（圖3，A）。白菜幼苗葉片可溶性糖含量在各處理下的變化趨勢與脯氨酸含量相似，只是經(jīng)過H2S預(yù)處理的幼苗葉片中可溶性糖含量顯著高于CK（圖3，B）?？梢姡谡ＩL狀態(tài)下，HA 處理對白菜幼苗葉片脯氨酸和可溶性糖的積累均沒有顯著影響，而H2S能夠引起可溶性糖含量的顯著增加；4 ℃冷脅迫及其與H2S、HA 共同處理均能顯著提高白菜幼苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量，并以H2S預(yù)處理表現(xiàn)最突出。即外源H2S在白菜幼苗抵御冷脅迫過程中能顯著促進(jìn)體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖的積累。

2．4 外源H2S 對冷脅迫下白菜幼苗光合特性的影響

有研究表明，植物在受到干旱和鹽脅迫后其光合作用效率會顯著降低，從而影響植物的生長狀態(tài)［23］。與CK 相比，HA 對白菜幼苗葉片Pn無顯著影響，而H2S 預(yù)處理則可使其顯著升高，4 ℃冷脅迫可顯著減弱Pn；與4℃冷脅迫相比，葉片Pn在H2S＋4 ℃處理下顯著提高，而在HA＋4 ℃處理下無顯著變化（圖4，A）。白菜幼苗葉片Tr在H2S和HA 處理下與CK 相比未見顯著變化，卻受到4 ℃冷脅迫顯著抑制；同時，H2S＋4 ℃、HA＋4 ℃處理幼苗葉片Tr與4℃冷脅迫相比未見明顯變化，即外源H2S對Tr的影響在低溫脅迫下并不顯著（圖4，B）。白菜幼苗在經(jīng)過4℃處理后葉片氣孔與CK 相比有一定程度的關(guān)閉，且其Gs與H2S＋4 ℃、HA＋4 ℃處理的白菜幼苗處于同一水平，正常生長狀況下的3 個處理組Gs也無顯著性變化（圖4，C、F）。與CK 相比，H2S預(yù)處理可降低葉片Ci但未達(dá)到顯著水平，HA 預(yù)處理對Ci無明顯影響，4℃低溫脅迫可顯著提高Ci，以減弱白菜幼苗的光合作用，而H2S＋4 ℃處理白菜幼苗的Ci與單獨(dú)4 ℃和HA＋4 ℃處理相比顯著降低（圖4，D）。另外，單獨(dú)H2S預(yù)處理后白菜幼苗葉綠素含量顯著高于CK 和HA處理組，4 ℃低溫處理則可使其顯著降低；經(jīng)H2S預(yù)處理再進(jìn)行冷脅迫處理白菜幼苗的葉綠素含量顯著高于4℃低溫脅迫和HA＋4℃處理組（圖4，E）。可 見，正常生長狀況下，H2S對Tr，Gs和Ci并無顯著影響，但可使Pn和葉綠素含量顯著升高，而HA對以上5個指標(biāo)均無顯著作用；4 ℃低溫脅迫顯著抑制了白菜幼苗Pn、Tr和Gs，并減少葉片中葉綠素含量，同時使得Ci升高，而施加外源H2S則顯著緩解了低溫脅迫對Pn的抑制和葉綠素含量的減少，降低了Ci。即外源H2S預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)白菜幼苗由低溫引起的凈光合速率的減緩、胞間二氧化碳濃度的升高和光合色素含量的降低。

圖3 外源H2S對冷脅迫下白菜幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig．3 Influence of exogenous H2S on proline and soluble sugar content in cabbage seedlings under chilling stress

2．5 外源H2S對冷脅迫下白菜幼苗光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響

LHCB 基因編碼捕光蛋白，參與光的捕獲和傳遞過程，是光合作用起始過程中的一個重要組成部分［24］。正常培養(yǎng)溫度下，外源H2S 處理可以顯著提高白菜幼苗LHCB 基因家族中LHCB2．4、LHCB4、LHCB4．3、LHCB6的表達(dá)量；在4 ℃低溫脅迫條件下，其LHCB2．4、LHCB4、LHCB4．3 的表達(dá)量與CK 相比被顯著抑制，而H2S＋4 ℃處理中LHCB2．4和LHCB4．3基因表達(dá)量顯著高于4 ℃處理，HA＋4 ℃對LHCB6基因表達(dá)的抑制作用較單獨(dú)低溫脅迫更為明顯（圖5，A）。即外源H2S可以顯著提高LHCB 基因家族中LHCB2．4、LHCB4、LHCB4．3、LHCB6 的表達(dá)量，并且可以在一定程度上緩解由于低溫而造成的表達(dá)量抑制，從而提高在冷脅迫下白菜幼苗的捕光效果，防止由低溫對白菜幼苗光合作用所產(chǎn)生的抑制現(xiàn)象。

鐵氧還蛋白和硫氧還蛋白在植物光合作用的電子傳遞過程發(fā)揮重要的作用，H2S預(yù)處理對于這兩類蛋白編碼基因表達(dá)不論在正常生長溫度還是低溫脅迫下均有極顯著的上調(diào)作用，4 ℃低溫脅迫對FC1、FD3、TRX－M4 和TRX－F1 基 因 表 達(dá) 的 抑 制更為顯著，而H2S合成被抑制后低溫對FC1、FD3表達(dá)的抑制作用更為明顯（圖5，B、C）。即H2S對白菜幼苗葉片光合作用電子傳遞鏈中鐵氧還蛋白和硫氧還蛋白編碼基因有顯著的上調(diào)作用，能夠緩解低溫對其造成的抑制，并且H2S的缺失使得低溫下FC1、FD3表達(dá)量的抑制現(xiàn)象更為突出。本實驗結(jié)果表明，外源H2S預(yù)處理可以顯著上調(diào)白菜幼苗捕光蛋白、鐵氧還蛋白和硫氧化蛋白相關(guān)編碼基因的表達(dá)量，從分子水平緩解由于低溫所造成的光合作用的抑制。

圖4 外源H2S對冷脅迫下白菜幼苗葉片光合作用相關(guān)指標(biāo)（A～E）和氣孔開度（F）的影響Fig．4 Influences of exogenous H2S on photosynthesis－related indicators（A－E）and stomatal aperture（F）in cabbage seedling leaves under chilling stress

圖5 H2S對冷脅迫下白菜幼苗葉片光合作用相關(guān)基因LHCB（A）、Fd（B）和Trx（C）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig．5 The regulation of H2S on the expression of photosynthesis－related genes LHCB（A），F(xiàn)d（B）and Trx（C）in cabbage seedlings under chilling stress

3 討 論

植物在冷脅迫過程中為了應(yīng)對低溫所造成的傷害，體內(nèi)脯氨酸、可溶性糖等物質(zhì)含量升高并積累［25］，在一定低溫處理時間內(nèi)H2S 合成酶基因表達(dá)量以及產(chǎn)率均隨處理時間逐漸升高，說明H2S可能參與到白菜幼苗應(yīng)對冷脅迫的過程，但低溫仍然造成白菜幼苗生長緩慢、萎蔫，這可能是由于內(nèi)源H2S含量較少，不能夠應(yīng)對長時間低溫脅迫所致，所以本實驗加入外源H2S進(jìn)行預(yù)處理以驗證H2S對冷脅迫下白菜幼苗生長及光合作用的影響。根據(jù)本實驗室已有研究結(jié)果，本實驗采用NaHS處理濃度為5μmol·L－1，因為此濃度下白菜幼苗的生長狀況最佳。

在本研究中H2S能顯著提高白菜幼苗光合作用過程中捕光蛋白、鐵氧化蛋白和硫氧還蛋白相關(guān)編碼基因的表達(dá)量，這3類基因所編碼的蛋白在植物光粒子捕捉和光合系統(tǒng)電子傳遞鏈過程中發(fā)揮著重 要 的 作 用［16－18，26］，其 表 達(dá) 量 的 增 加 在 一 定 程 度 上可以增加葉綠體對光粒子的捕捉，增強(qiáng)光合系統(tǒng)中電子傳遞的效率，從而提高低溫脅迫下白菜光合作用強(qiáng)度，促進(jìn)白菜的生長。在光合特性相關(guān)指標(biāo)中，植物氣孔導(dǎo)度與溫度和光照直接相關(guān)，在光照條件相同的情況下低溫可使植物氣孔關(guān)閉，蒸騰速率降低，光合作用強(qiáng)度減弱。本實驗中H2S預(yù)處理后再進(jìn)行4 ℃處理的幼苗氣孔關(guān)閉，蒸騰速率并沒有因為H2S預(yù)處理而升高，這一結(jié)果與Jin等［8］的研究結(jié)果H2S通過關(guān)閉氣孔來增加抗旱性一致，但是在本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計中，并未看到H2S＋4 ℃處理與單獨(dú)4 ℃和HA＋4 ℃處理葉片的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度有明顯差異，可能是H2S與4 ℃低溫對氣孔的關(guān)閉均有所作用，但這一作用并不能夠疊加。而外源H2S能顯著上調(diào)白菜葉片捕光蛋白等光合作用相關(guān)基因表達(dá)量，顯著增強(qiáng)白菜葉片Pn，這一結(jié)果與Chen等［5］的研究中H2S提高光合作用的結(jié)果是一致的。所以，H2S提高冷脅迫下白菜幼苗的光合作用強(qiáng)度并不是通過增加氣孔開度和增強(qiáng)蒸騰速率來實現(xiàn)的，而是通過直接影響白菜幼苗葉片的凈光合速率和胞間二氧化碳濃度起作用。

依據(jù)本研究的數(shù)據(jù)，推測H2S提升白菜幼苗對冷的耐受能力可能至少涉及2個生理過程，一方面是通過調(diào)節(jié)光合作用相關(guān)基因的表達(dá)量，增加冷脅迫下葉片Pn來提升白菜幼苗光合強(qiáng)度。因為H2S可以提高1，5－二磷酸核酮糖羧化酶的活性，增加植物對碳的固定，進(jìn)而促進(jìn)從CO2到葡萄糖的合成過程［5］。因此無論有無低溫脅迫H2S 均可增加白菜幼苗可溶性糖的含量，為其生長提供更多的有機(jī)物，當(dāng)脅迫來臨時也能夠更好地應(yīng)對以促進(jìn)生長。另一方面H2S可增加低溫脅迫下白菜幼苗體內(nèi)脯氨酸含量，藉此調(diào)節(jié)葉片細(xì)胞的滲透性，減少水分的喪失，為細(xì)胞代謝提供相對穩(wěn)定的環(huán)境，緩解冷脅迫帶來的危害。

綜上所述，在冷脅迫條件下，外源H2S 預(yù)處理能通過調(diào)節(jié)白菜幼苗光合作用相關(guān)基因的表達(dá)量，增強(qiáng)葉片光合作用強(qiáng)度，增加有機(jī)物的累積，同時調(diào)節(jié)葉片細(xì)胞的滲透性，減少水分的喪失，提高幼苗對冷脅迫的耐受能力，減輕損傷，緩解低溫脅迫對白菜幼苗生長的影響。

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