杜明亮，錢海燕，吳明月，李全利

鈦種植體表面固定生物素的實(shí)驗(yàn)研究

杜明亮，錢海燕，吳明月，李全利

摘要目的 利用生物素－親和素系統(tǒng)，將生物素共價鍵合在鈦基材表面，為鈦種植體表面接枝生物活性分子提供新的實(shí)驗(yàn)方法。方法 使用3-氨丙基膦酸（APP）對鈦基材表面進(jìn)行酸蝕處理并使其獲得游離氨基，由碳二亞胺（EDC）介導(dǎo)，通過與羧基反應(yīng)形成酰胺鍵以實(shí)現(xiàn)生物素－親和素系統(tǒng)在鈦種植體表面的固定。結(jié)果 通過環(huán)境掃描電鏡、傅立葉變換紅外光譜、X射線光電子能譜、免疫熒光等檢測方法對樣品進(jìn)行表征，證實(shí)鈦基材表面已成功接枝生物素。結(jié)論采用生物素－親和素系統(tǒng)，可以在氨基化的鈦基材表面成功接枝生物素，為鈦種植體表面生物化修飾的研究提供新的方法和思路。

關(guān)鍵詞鈦種植體；3-氨丙基膦酸；生物素－親和素系統(tǒng)；共價鍵合

2015－01－14接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

生物化修飾是目前鈦種植體表面改性研究的熱點(diǎn)［1］，該方法是將具備特定信號識別功能的生物分子與生物材料相結(jié)合，誘導(dǎo)特殊細(xì)胞分化和組織改造，以期實(shí)現(xiàn)對材料的表面改性。對于牙種植體而言，就是利用骨組織形成過程中的一些決定性的生物活性分子，影響成骨細(xì)胞增殖和分化，最終促進(jìn)骨整合。而如何將這些特定的生物活性分子固定在種植體的材料表面，一直是該方面研究的難點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)首先使用3-氨丙基膦酸（3-aminopropylphosphonic acid，APP）對鈦基材進(jìn)行表面處理，膦酸基團(tuán)與TiO2形成共價鍵合，使鈦基材表面獲得游離氨基；再利用生物素－親和素系統(tǒng)，與生物素上的羧基形成酰胺鍵，從而將生物素固定在基材表面，由此為進(jìn)一步接枝生物大分子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 原料與試劑 鈦棒購于陜西寶雞非鐵金屬有限公司；APP購于美國Sigma－Aldrich公司；生物素購于北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司；親和素標(biāo)記的Cy3熒光試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。

1．2 實(shí)驗(yàn)儀器 環(huán)境掃描電鏡（ESEM，荷蘭Philips公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國Thermo Fisher Scientific公司）；X射線光電子能譜儀（XPS，美國Thermo-VG Scientific公司）；正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1．3 方法

1．3．1 鈦片的制備和酸蝕 將鈦棒加工成直徑為10 mm厚1 mm的圓形鈦片，金相砂紙打磨至鏡面效果，依次用丙酮、乙醇、去離子水清洗2次共1 h。將上述鈦片置于10 mmol／L APP中，60℃恒溫下靜置18 h后取出，吸去表面液體，120℃高溫干燥8 h，用去離子水超聲清洗干燥后備用，樣品記為APP／TiO2。分別使用ESEM、FTIR及XPS對鈦片進(jìn)行表征。

1．3．2 鈦片表面接枝生物素 將10 mg生物素加入到20 ml 0.05 mol／L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoehane sulfonic acid monohydrate，MES）水溶液中，然后依次加入2.2×10－5mol N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）和3．6×10－5mol 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺［1-Ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl）carbodiimi-dehydrochloride，EDC］，攪拌后將鈦片置于上述溶液中，于室溫反應(yīng)4 h，用去離子水超聲清洗，真空干燥。樣品記為Bio／APP／TiO2。

1．3．3 免疫熒光分析 在已生物素化的鈦片表面滴加l%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，室溫下于濕盒內(nèi)孵育30 min，吸出BSA。用PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。然后在生物素化鈦片、光滑鈦片及APP酸蝕鈦片表面滴加0.01% 的20 μl親和素標(biāo)記的Cy3熒光素，濕盒內(nèi)避光室溫孵育30 min。用含1‰Tween-20的PBS緩沖液超聲清洗20 min，后漂洗3次，每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2．1 鈦片表面形貌觀察 ESEM觀察顯示鈦片在

APP處理前表面較光滑，可見有打磨時留下的機(jī)械劃痕。鈦片經(jīng)APP處理后，表面呈現(xiàn)均勻散在分布的坑凹、多孔狀結(jié)構(gòu)，其底部及周壁有微孔，孔徑約1～2 μm。見圖1。

2．2 APP處理后鈦片表面紅外光譜分析 FTIR顯示在2 800～3 000 cm－1處出現(xiàn)了連續(xù)的波峰，分別為CH2的對稱和反對稱伸縮振動峰，提示有烷烴鏈的存在；而在1 533 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰為NH2變角振動峰，提示有NH2出現(xiàn)。以上結(jié)果表明APP已固定在鈦片表面，并證實(shí)經(jīng)APP處理的鈦片表面已獲得了游離的氨基。見圖2。

2．3 APP處理后鈦片表面XPS分析 XPS分析圖譜顯示，與光滑鈦片比較，經(jīng)APP處理后的鈦片圖譜在133 eV、191 eV兩處出現(xiàn)了P元素波峰。見圖3。APP處理后鈦片N、P元素的含量較光滑鈦片明顯提高，表明APP已固定于鈦片表面。見表1。

表1　APP處理前后鈦片表面薄膜各元素含量（%）

2．4 免疫熒光分析 熒光顯微鏡下可見光滑鈦片和APP處理后鈦片表面熒光較少，結(jié)果為陰性，而接枝生物素的鈦片表面可見大量均勻分布的熒光，結(jié)果為陽性，這表明生物素、親和素已在鈦基材表面接枝成功。見圖4。

3 討論

3．1 鈦基材表面獲得-NH2功能基團(tuán) 近年來，運(yùn)用生物化技術(shù)對生物材料進(jìn)行表面改性取得可喜進(jìn)展，經(jīng)過生物化改性后，材料表面可獲得更好的骨誘

導(dǎo)性，種植體能主動與機(jī)體結(jié)合，促進(jìn)了骨整合［2］。進(jìn)行生物化修飾的前提和基礎(chǔ)是材料表面必需具有豐富的反應(yīng)性功能基團(tuán)，這些功能基團(tuán)主要包括羧基、羥基、氨基。鈦為惰性金屬，其表面為致密的TiO2氧化膜，僅含少量羥基，無法滿足其表面固定生物大分子的需求。如何將生物分子與鈦種植體良好結(jié)合充分發(fā)揮其活性，是目前生物化修飾的中心問題［3］。本實(shí)驗(yàn)使用APP處理鈦種植體基材表面，其磷酸基團(tuán)與氧化鈦形成化學(xué)鍵結(jié)合，“尾部基團(tuán)”氨基游離于鈦基材表面，成為蛋白質(zhì)分子固定的“分子手臂”。膦酸鍵具有更好的抗水解性，穩(wěn)定性更佳［4］。經(jīng)過APP的酸蝕處理后，鈦種植體基材表面呈現(xiàn)出多孔的粗糙表面，這樣的表面形貌為蛋白質(zhì)的吸附及細(xì)胞的黏附、生長提供了良好的外部環(huán)境。

3．2 鈦基材表面固定生物素 生物素－親和素系統(tǒng)作為一種分子識別工具，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究［5］，其結(jié)合常數(shù)（Ka）高達(dá)1015L／mol，比抗原抗體之間的親和力（Ka＝105～11L／mol）至少高1萬倍，并且不受試劑濃度、pH環(huán)境和蛋白變性劑等有機(jī)溶劑的影響。同時，生物素分子中側(cè)鏈末端的羧基很容易被活化，結(jié)合蛋白質(zhì)分子且不破壞其生化性質(zhì)，常用以標(biāo)記生物大分子。Nishi et al［6］使用生物素、親和素作為中介在有機(jī)聚合物上固定精氨酸－甘氨酸－天門冬氨酸（RGD）肽衍生物獲得成功，并且取得了良好的細(xì)胞學(xué)評價。親和素是一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，理論上可以特異性結(jié)合4個生物素分子。但是由于空間位阻的原因，在固體表面一般1分子親和素大約可以結(jié)合2分子的生物素衍生物［7－8］。本實(shí)驗(yàn)通過EDC／NHS／MES催化體系介導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)，首先通過羧基與氨基反應(yīng)生成酰胺鍵在氨基化的鈦基材表面固定生物素，然后再通過生物素、親和素的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)親和素在鈦基材表面的固定，為進(jìn)一步接枝各種目的蛋白大分子的生物素化衍生物奠定了可靠的基礎(chǔ)。經(jīng)過上述反應(yīng)程序，一方面通過氨基化鈦基材表面對生物素－親和素系統(tǒng)的結(jié)合，解決了鈦金屬表面對生物大分子固定的惰性問題，二者的共價鍵和方式為鈦基材表面生物固定的牢固性提供了切實(shí)的保障；另一方面，通過上述的多級放大效應(yīng)，亦克服了材料表面因空間位阻導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分子接枝量有限的難題。

親和素、生物素缺少能在紅外光譜中進(jìn)行區(qū)分鑒別的特征峰［9］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光分析來證明生物素－親和素已經(jīng)固定成功。在經(jīng)過APP處理后的鈦基材表面接枝生物素，然后滴加親和素標(biāo)記的Cy3熒光素，可見大量均勻熒光，表明生物素固定成功。

課題組的前期研究已獲得如下成果：以人顱骨成骨細(xì)胞作為陽性靶細(xì)胞，人牙齦成纖維細(xì)胞為陰性吸附細(xì)胞，對噬菌體展示十二肽庫進(jìn)行全細(xì)胞篩選獲得了與成骨細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽序列，固相合成該多肽并將其生物素化。在此基礎(chǔ)上，課題組后續(xù)準(zhǔn)備實(shí)施的研究如下：擬通過本實(shí)驗(yàn)將該特異性生物素化多肽固定在鈦種植體表面，再通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步檢測該特異性識別表面的生物學(xué)效應(yīng)。希望通過上述系列實(shí)驗(yàn)，為構(gòu)建人成骨細(xì)胞特異性識別牙種植體表面提供前期研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步能夠?yàn)檠婪N植體表面的生物化修飾研究提供新的思路和策略。

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◇預(yù)防醫(yī)學(xué)研究◇

The experimental study of immobilization of biotin on the titanium implant surface

Du Mingliang，Qian Haiyan，Wu Mingyue，et al
（Stomatologic Hospital & College，Anhui Medical University，Key Lab．of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

AbstractObjective To covalently immobilize biotin on the surface of the titanium substrate by biotin-avidin technology．Eventually，the study provides new experimental methods for titanium implant surface grafting bioactive molecules．Methods The surface of the titanium substrate was treated by 3-aminopropylphosphonic acid（APP），and enabled them to obtain free amino groups，which reacted with carboxyl groups to form amide bond to immobilize the biotin-avidin system on the surface of titanium implant by carbodiimide（EDC）-mediated．Results The samples were characterized by environmental scanning electron microscopy，fourier transform infrared spectroscopy，X-ray photoelectron spectroscopy and immunofluorescence，which demonstrated that biotin was successfully bonded to the titanium surface．Conclusion The biotin can be successfully immobilized on the surface of titanium implant with grafted amino groups through biotin-avidin technology．This study develops a new research approach and experimental foundation of the biolization modification on the surface of titanium implant．

Key wordstitanium implant；3-aminopropylphosphonic acid；biotin-avidin system；covalently bonding

作者簡介：杜明亮，男，碩士研究生；吳明月，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wumingyue321＠126．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81170993）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0463－04

中圖分類號R 318．08