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學(xué)科動(dòng)態(tài)

鈣蛋白酶1與動(dòng)物雄性生殖

崔曉慧1，2，王秀革2，李虹1,2，楊春紅2，仲躋峰2，侯明海2，尹苗1*，王長法2*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

[摘要]鈣蛋白酶1(calpain1,CAPN1)在動(dòng)物各組織中普遍表達(dá)，廣泛參與機(jī)體的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等生理過程。鈣蛋白酶1存在于精子的頭部，參與精子發(fā)生和頂體反應(yīng)等生理過程，對精子發(fā)揮正常功能具有重要的作用。本文主要闡述了鈣蛋白酶1的結(jié)構(gòu)、功能以及與雄性生殖相關(guān)性研究進(jìn)展，為人們進(jìn)一步研究該基因奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]鈣蛋白酶1；精子發(fā)生；遺傳變異；分子調(diào)控

鈣蛋白酶是在動(dòng)物各組織中普遍表達(dá)的一類依賴于鈣激活的半胱氨酸巰基內(nèi)肽酶，廣泛參與機(jī)體細(xì)胞水平的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等生理過程[1]。自從Guroff等[2]在大鼠腦組織中首次發(fā)現(xiàn)這種可溶的鈣離子依賴的中性蛋白酶以來，關(guān)于其研究久盛不衰。Ohnos等[3]第1次克隆了該酶的cDNA。1991年，該酶被正式命名為“鈣蛋白酶”。在大多數(shù)哺乳類組織和細(xì)胞中，根據(jù)對Ca2+的敏感度不同，將兩種鈣蛋白酶分別命名為CAPN1和CAPN2，相對應(yīng)需要較低和較高的Ca2+濃度。鈣蛋白酶小亞基單位(calpainsmallsubmit1,CAPNS1)是CAPN1和CAPN2的共同調(diào)節(jié)亞單位[4]。Sivakumar等[5]研究表明，蛋白酶家族成員可直接參與半胱氨酸蛋白酶caspase家族成員的剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了確保配子的質(zhì)量，精子發(fā)生過程中的細(xì)胞凋亡更加重要。鈣蛋白酶是睪丸生殖細(xì)胞凋亡的主要感受器，當(dāng)CAPN1 RNA表達(dá)水平增加、活力更高時(shí)，類caspase-3活力明顯減弱，并且鈣蛋白酶抑制劑E64d減少M(fèi)Tp53睪丸的原位末端標(biāo)記(TUNEL)[6]。另外，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，CAPN1基因與雄性弱精子活力相關(guān)[7]。因此，鈣蛋白酶與雄性生殖相關(guān)，對CAPN蛋白和基因的研究可為雄性不育的治療提供線索。本文主要闡述了雄性生殖過程中鈣蛋白酶的功能與作用，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1CAPN1的結(jié)構(gòu)與功能

1.1　CAPN1的結(jié)構(gòu)

牛鈣蛋白酶1基因位于29號染色體上，全長36 854 bp，包括22個(gè)外顯子，21個(gè)內(nèi)含子，編碼一條含716個(gè)氨基酸的肽鏈(圖1)。CAPN1蛋白由大小兩個(gè)亞基組成，其中大亞基由DV到DVI四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，小亞基由DV(甘氨酸富集區(qū))和DVI 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。大小亞基由不同的基因編碼，大亞基的編碼基因?yàn)镃APN1，小亞基的編碼基因?yàn)镃APNS1[8]。大小亞基分別發(fā)揮催化和調(diào)控的功能，大亞基自身可以保持蛋白水解活力，而小亞基需要分子伴侶激活，通過與大亞基N端相互作用進(jìn)而促進(jìn)大亞基發(fā)生適當(dāng)?shù)恼郫B，從而發(fā)揮調(diào)控作用。CAPN家族都要經(jīng)過 Ca2+誘導(dǎo)發(fā)生自體溶解，并且各種蛋白酶發(fā)生溶解的位點(diǎn)相似，但不完全相同。在牛CAPN1蛋白中，大亞基N端15個(gè)氨基酸首先被移除得到一個(gè)78 kDa大小的中間產(chǎn)物，然后進(jìn)一步移除12個(gè)氨基酸，最終得到75 kDa大小的產(chǎn)物[9]。根據(jù)同源性建模，已經(jīng)得出牛CAPN1大催化亞基的結(jié)構(gòu)模型[9]。模型中牛CAPN1大亞基包含了大約700個(gè)氨基酸組成的復(fù)合位點(diǎn)(DV到DVI)，并且在未被活化狀態(tài)時(shí)在N端存在EF-手型結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖2a)[9]。圖中為牛CAPN1和兔CAPN2分別在鈣離子激活(b)和未激活(a)狀態(tài)時(shí)的結(jié)構(gòu)，兩個(gè)蛋白酶的大亞基大小均為80 kDa，并且它們的結(jié)構(gòu)非常相似。

圖1　牛CAPN1基因結(jié)構(gòu)圖

圖2　牛Calpain-1和兔Calpain-2分別在鈣離子激活(b)和

1.2　CAPN1的功能

CAPN類蛋白酶代表近2%的全基因產(chǎn)物[10]，屬于鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白酶，當(dāng)鈣離子存在時(shí)，酶原被激活，能夠水解底物蛋白氨基酸之間的α肽鍵。由于多方面的生理功能，CAPN及其內(nèi)源性抑制蛋白calpastatin(CAST)已經(jīng)成為醫(yī)藥和生物技術(shù)的研究重點(diǎn)。除此之外，由于在編碼水平抑制CAPN亞型的功能障礙，它們發(fā)揮高活性狀態(tài)或病理狀態(tài)都與不同的疾病相關(guān)。蛋白酶聚集可能會(huì)引起活力的降低，并且可能引起炎癥位點(diǎn)過度的免疫反應(yīng)[11-12]。關(guān)于該鈣蛋白酶最多的研究是與肉質(zhì)嫩度相關(guān)，最新的研究表明CAPN1基因的多態(tài)性與雞肉的嫩度密切相關(guān)[13]。此外，鈣蛋白酶1也參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號通路[14]。

CAPN1的激活原理和作用機(jī)制的調(diào)節(jié)過程非常復(fù)雜，其活性主要由一種特異的鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)調(diào)控。Calpastatin僅由一個(gè)基因編碼，唯一作用是抑制CAPN的活性，但卻能運(yùn)用不同位置的啟動(dòng)子以及選擇性剪切模式產(chǎn)生十幾種異構(gòu)體，最后翻譯成分子量為17~100 kDa不等的各種不同蛋白。人的睪丸特異calpastatin蛋白大小約為68 kDa，由一個(gè)由40個(gè)氨基酸組成的N端結(jié)構(gòu)域與II、III和IV結(jié)構(gòu)域組成，其中N端結(jié)構(gòu)域?yàn)椴G丸特異，其余結(jié)構(gòu)域部分和其他體細(xì)胞calpastatin蛋白完全一樣[15]。

2鈣蛋白酶1與雄性生殖相關(guān)研究

2.1　CAPN1在雄性生殖系統(tǒng)中的定位

Rojas等[16]第一次在人類精子中發(fā)現(xiàn)CAPN1、CAPN2的分布，并且用免疫印記的方法獲得了一條68 kDa大小的calpastatin蛋白條帶；獼猴CAPN1和CAPN2同時(shí)在精子中表達(dá)，超微結(jié)構(gòu)研究表明這兩種鈣蛋白酶位于細(xì)胞質(zhì)膜和頂體外膜之間[9]。體細(xì)胞中的鈣蛋白酶位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，最適pH為7.5。而精子細(xì)胞中的鈣蛋白酶主要分布在皮層顆粒，發(fā)揮最大酶活力的pH為9.0~9.5。CAPN2主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，而CAPN1主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和皮層顆粒，但有活性的鈣蛋白酶主要存在于皮層顆粒上。精子中鈣蛋白酶發(fā)揮最大活力的pH相對體細(xì)胞較高，可能與精子的生理活性有關(guān)。在保持較低pH條件下，精子保持沉默狀態(tài)；當(dāng)pH>7.5時(shí)，精子被激活，新陳代謝迅速加快并獲得與卵子結(jié)合的能力。在精子處于完全激活的狀態(tài)時(shí)，鈣蛋白酶的活力最大。

2.2　CAPN1在精子發(fā)生中的表達(dá)和作用

Sultana等[17]研究了鈣蛋白酶在精子發(fā)育過程中的表達(dá)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在大鼠生長到20~25 d時(shí)，即精母細(xì)胞( spermatocytes)發(fā)生減數(shù)分裂的旺盛時(shí)期，睪丸中的CAPN1基因表達(dá)量顯著升高，而CAPN2保持相對穩(wěn)定，推測CAPN1在精子細(xì)胞發(fā)生過程中起重要作用。在小鼠中，精子發(fā)生的各個(gè)階段都能檢測到CAPN1和CAPN2的mRNA和蛋白的表達(dá)，但CAPN1在晚期的次級精母細(xì)胞( second spermatocytes) 和早期的精細(xì)胞( spermatids) 中表達(dá)量顯著升高。

CAPN1主要參與精子發(fā)生中的細(xì)胞凋亡過程[18]。在成年動(dòng)物個(gè)體中，細(xì)胞系要進(jìn)行連續(xù)的細(xì)胞分化，進(jìn)而要嚴(yán)格控制細(xì)胞系增殖和凋亡之間的平衡。除了自我平衡的控制外，為了確保配子的質(zhì)量，精子發(fā)生過程中的細(xì)胞凋亡更加重要。在一個(gè)細(xì)胞凋亡缺陷的機(jī)體中，受損的細(xì)胞可以存活，并且可將突變性狀傳遞給后代，這可以解釋為什么成年雄性生殖細(xì)胞對細(xì)胞凋亡非常敏感。在正常的情況下，永久分化導(dǎo)致細(xì)胞死亡率高達(dá)50%。精子發(fā)生的開始伴隨著精原細(xì)胞的有絲分裂，從精原細(xì)胞的二倍體到初級精母細(xì)胞四倍體的轉(zhuǎn)變過程標(biāo)志著進(jìn)入了減數(shù)分裂。隨后進(jìn)入粗線期，初級精母細(xì)胞染色體減半形成二倍體的次級精母細(xì)胞。這標(biāo)志著進(jìn)入了精子形成和末端成熟過程，最終形成了單倍體的精子細(xì)胞(如圖3)。在精細(xì)胞凋亡過程中，鈣蛋白酶在睪丸局部缺血或者再灌注時(shí)可被激活[19]。在細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加時(shí)，CAPN1和CAPN2是在體外普遍被激活的蛋白酶(分別僅需要微摩爾和毫摩爾鈣離子濃度)[20]。在它們的底物中，一些是凋亡效應(yīng)器：兩種鈣蛋白酶任意一個(gè)被激活，可以作為Bcl2家族成員；或者任意一個(gè)被滅活，可以相當(dāng)于p53和caspase。在轉(zhuǎn)基因(MTp53)雄性個(gè)體中，表達(dá)p53的次級精母細(xì)胞和精細(xì)胞要經(jīng)受非半胱天冬酶依賴的細(xì)胞死亡；鈣蛋白酶是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)器，盡管在正常精子形成過程中存在被激活的caspase-9和caspase-3的成分，但是鈣蛋白酶仍是細(xì)胞凋亡的主要感受器。因此，鈣蛋白酶對精子正常的發(fā)生具有十分重要的作用。

圖3　哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程(Dym 1994)

2.3　CAPN1在頂體反應(yīng)中的作用

在受精過程中，精子與卵子透明帶結(jié)合，并激活精子細(xì)胞膜G蛋白偶聯(lián)的信號通路。Ca2+通過活化的G蛋白通路流入細(xì)胞內(nèi)，引起胞內(nèi)Ca2+濃度上升，進(jìn)而誘發(fā)頂體反應(yīng)。頂體反應(yīng)能夠使精子穿過透明帶，與卵子發(fā)生受精作用[21]。在人類和其它脊椎動(dòng)物中的受精作用研究證明，Ca2+在精子穿透卵母細(xì)胞的生物化學(xué)反應(yīng)中具有重要作用，特別在精子細(xì)胞和卵母細(xì)胞膜的融合過程中具有最重要的作用。Ca2+作為小的信號傳感器能夠特異的調(diào)控精子和卵母細(xì)胞膜融合過程[22]。因此，獲能精子在沒有鈣離子的條件下只能和卵細(xì)胞碰撞并附著，不能發(fā)生細(xì)胞膜的融合[23]。精子中的鈣蛋白酶可被Ca2+激活，并且其蛋白水解活性能夠有效的降低特異的鈣蛋白酶抑制蛋白的活性。鈣蛋白酶系統(tǒng)蛋白在頂體附近的分布以及其與Ca2+濃度的密切關(guān)系，說明該系統(tǒng)可能在頂體反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

Rojas和Moretti-Rojas對calpain-calpastatin系統(tǒng)在頂體反應(yīng)中的作用的研究發(fā)現(xiàn)，精子中加入CAPN的抑制因子(calpaininhibitor-I) 后，精子的滲入率顯著降低，但是該抑制因子對精子活力以及卵母細(xì)胞沒有明顯作用。此外，加入CAPN1和CAPN2的抗體同樣對頂體反應(yīng)有抑制作用[24]。隨后，大量研究表明CAPN的各種抑制劑有時(shí)也能不同程度的降低精子活力以及抑制頂體反應(yīng)的發(fā)生[25-26]。

2.4　CAPN1基因多態(tài)性與精子活力的研究

生育力低下是指任何形式的生育能力下降和生殖能力下降[27]。對于廣泛進(jìn)行人工授精的奶牛遺傳改良系統(tǒng)來說，公牛生育低下(即隱性不育公牛)可引起較大的經(jīng)濟(jì)損失。生育力低下的雄性，其病變的精液表現(xiàn)為數(shù)量減少和精子運(yùn)動(dòng)能力減弱，最終導(dǎo)致繁殖力低下[28]。隱性不育公牛的精液比完全不育公牛的精液對奶牛群影響更大，因?yàn)楹笳邩O易被發(fā)現(xiàn)，從而較早被淘汰。而前者可能在大面積使用后才被發(fā)現(xiàn)，此時(shí)已經(jīng)給牛群造成重大的經(jīng)濟(jì)損失并且有損精子的分銷和銷售。弱精子活力公牛在牛AI行業(yè)逐漸變成了嚴(yán)重問題之一。在生產(chǎn)過程中，公牛精液中弱精子活力的比重逐漸增加。

Druet等[29]研究證實(shí)，精液品質(zhì)受遺傳因素影響，該研究報(bào)道了和牛精液質(zhì)量相關(guān)的遺傳參數(shù)。精液的一些生產(chǎn)特性，比如精液體積和濃度會(huì)適當(dāng)?shù)倪z傳，遺傳力從0.15到0.30，但對于精液的一些質(zhì)量特性來說，比如精子活力和畸形率，具有高度遺傳力(接近0.6)。

影響精液品質(zhì)的基因研究主要是鑒定影響雄性生育能力不足(精子減少癥和精子活力不足癥)，在很多研究中發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)影響與生育相關(guān)疾病[30]。許多研究應(yīng)用全基因組相關(guān)性研究(GWAS)驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)[31-32]。在公牛精子中也有類似的研究[33]。在婆羅門牛X染色體上，有一大片區(qū)域都與精子質(zhì)量相關(guān)[34]，其中有一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)影響精子的運(yùn)動(dòng)能力，且該SNP位點(diǎn)也位于X染色體上。此外，大量研究報(bào)道了許多與精子生產(chǎn)性能相關(guān)的SNP，這表明多態(tài)性與精子的質(zhì)量有密切關(guān)系，但是單個(gè)SNP的影響較小，因而需要綜合分析分散在幾乎所有染色體上的SNP[31-32,35]。

利用GoldenHelix SVS7軟件進(jìn)行全基因組相關(guān)性分析來評估單核苷酸多態(tài)性(SNP)與弱精癥的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，與弱精癥相關(guān)性最高的SNP主要位于24號染色體的rs110876480位點(diǎn)、5號染色體上的rs110827324和rs29011704位點(diǎn)以及1號染色體上rs110596818位點(diǎn)。除此之外，位于29號染色體的CAPN1基因與精子的運(yùn)動(dòng)性和精液的生化反應(yīng)密切相關(guān)?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，弱精癥具有多基因遺傳性，但是也有可能是由于多態(tài)性促進(jìn)了分子標(biāo)記輔助選擇。鑒定與弱精子活力相關(guān)的基因組區(qū)域可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)在人工授精過程中不適合的精子。

3鈣蛋白酶系統(tǒng)與雄性生殖疾病的關(guān)系

雄性哺乳動(dòng)物的睪丸扭轉(zhuǎn)(Testicular torsion) 會(huì)導(dǎo)致睪丸內(nèi)細(xì)胞的缺血并發(fā)生壞死或凋亡，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的NO，同時(shí)CAPN蛋白的活性也顯著升高，在此過程中如加入CAPN的抑制劑，則抑制CAPN的蛋白水解活性，可以抑制精原細(xì)胞的凋亡和壞死，說明抑制CAPN可以對睪丸扭轉(zhuǎn)損傷的恢復(fù)有一定作用，因而CAPN蛋白可以作為治療睪丸扭轉(zhuǎn)一個(gè)藥物靶點(diǎn)[36-37]。 Umemoto等[38]進(jìn)一步研究了發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)過程中未發(fā)生損傷的細(xì)胞中CAPN蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠一側(cè)的睪丸發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后，在另一側(cè)睪丸的精母細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了大量的CAPN1， 而CAPN2沒有明顯的變化；在未發(fā)生損傷的外周細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了凋亡的現(xiàn)象，而CAPN抑制劑也可以抑制這些細(xì)胞的凋亡。

鈣蛋白酶系統(tǒng)在雄性生殖過程中具有重要的作用。隨著對鈣蛋白酶系統(tǒng)的進(jìn)一步研究，其發(fā)揮作用的機(jī)制更加的清楚，在臨床上可以作為藥物的潛在靶位點(diǎn)，為治療相關(guān)疾病提供新途徑，還可以運(yùn)用到動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域，提高動(dòng)物的繁殖力，更好的為人類服務(wù)。

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Calpain 1 and Male Animal Reproduction

CUI Xiao-hui1,2,WANG Xiu-ge2,LI Hong1,2,YANG Chun-hong2,ZHONG Ji-feng2,

HOU Ming-hai2,YI Miao1*,WANG Chang-fa2*

(1.CollegeofLifeScience,ShandongNormalUniversity,Ji'nan,Shandong250014;

2.DairyCattleResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Ji'nan,Shandong250100)

Abstract:Calpain 1 (calpain1, CAPN1) is widely expressed in various tissues in animals and described in a wide range of cellular processes including apoptosis, migration and cell cycle regulation. Calpain is present in the sperm head and participates in spermatogenesis and acrosome reaction. Calpain 1 has an important role in the normal functioning of sperm. The paper described the architecture, function of calpain and its correlation with male reproduction for further gene research.

Key words:CAPN1; spermatogenesis; genetic variation; molecular regulation

[中圖分類號]S811.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號]1005-5228(2015)11-0001-05

*[通訊作者]尹苗(1972-)，女，山東聊城人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物發(fā)育的機(jī)理。E-mail：yinmiao@sdnu.edu.cn；王長法(1967-)，男，江蘇淮安人，博士，研究員，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：wangcf1967@163.com

[作者簡介]崔曉慧(1990-)，女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail：cxhddk@163.com

[基金項(xiàng)目]山東省農(nóng)業(yè)良種工程種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用項(xiàng)目(2014LZ)；崗位科學(xué)家(CARS-37)；國家自然基金(31401049，31401050)；山東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(SDAIT-12-011-02)

*[收稿日期]2015-04-10修回日期：2015-05-05