李俞池林首任羅滿玲郭 煥, 3吳漢偉江智茂桂耀庭**. 北京大學深圳醫(yī)院, 深圳市男性生殖與遺傳重點實驗室（深圳 58036）;2. 汕頭大學醫(yī)學院; 3. 廣州醫(yī)科大學; . 深圳市第二人民醫(yī)院

·論 著·

睪丸特異性基因BC05162851628在小鼠中的表達及生物信息學分析*

李俞池1, 2林首任1羅滿玲1, 2郭 煥1, 3吳漢偉4江智茂1桂耀庭1**
1. 北京大學深圳醫(yī)院, 深圳市男性生殖與遺傳重點實驗室（深圳 518036）;
2. 汕頭大學醫(yī)學院; 3. 廣州醫(yī)科大學; 4. 深圳市第二人民醫(yī)院

摘要目的 研究睪丸特異性基因BC051628在小鼠中的表達特征。方法 通過分析小鼠基因表達譜芯片，發(fā)現(xiàn) BC051628基因特異性表達于睪丸組織。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）、蛋白免疫印跡法（Western blot）及免疫組化等方法分析該基因在小鼠不同組織及睪丸不同發(fā)育階段的表達特征。利用生物信息學軟件對該基因進行相關(guān)生物信息學分析。結(jié)果 BC051628基因在小鼠各組織中呈現(xiàn)睪丸特異性表達并伴隨明顯年齡依耐性。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)BC051628蛋白主要定位于精原細胞、精母細胞及圓形精子。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)BC051628基因編碼蛋白氨基酸序列在人和小鼠具有高度同源性，提示該基因在哺乳動物進化過程中十分保守。結(jié)論 BC051628屬于睪丸特異性基因，可能在生精過程發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞基因; 睪丸; 計算生物學; 精子發(fā)生

睪丸是人體重要的生殖器官，睪丸中精子正常發(fā)生是人類繁衍的基礎(chǔ)。精子發(fā)生（spermatogenesis）是一個非常復雜且有序的過程，它涉及到多種睪丸特異性基因在不同時間和空間的先后表達及相互作用，例如：Cerm[1]，Dmc1[2]，Hist1h1t[3]，Cdc2[4]，np1[5]等。因此研究這些基因的表達特征及功能，對掌握精子發(fā)生的內(nèi)在機制及闡明男性生精障礙具有重要作用[6]。

基因表達譜芯片作為基因表達信息的重要數(shù)據(jù)庫，在基因識別、繪制基因表達圖譜、尋找新基因等研究領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[7]。目前美國國家生物信息中心（NCBI）的基因表達譜芯片數(shù)據(jù)庫（GEO DataSets）已經(jīng)擁有30余萬條小鼠睪丸基因表達數(shù)據(jù)記錄[8]，為尋找小鼠睪丸特異性新基因提供了基礎(chǔ)。我們實驗室通過對小鼠基因表達譜芯片數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn) BC051628 基因特異性表達于睪丸。進而通過采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 及實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）等實驗方法證實，BC051628屬于睪丸特異性基因。經(jīng)生物信息學分析，BC051628基因在哺乳動物進化過程中十分保守。該基因發(fā)現(xiàn)為研究精子發(fā)生提供了一個新的候選基因。

材料與方法

一、材料

總 RNA 抽提試劑 Trizol 購自 Invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara 生物公司。PCR 擴增引物由 Invitrogen 廣州公司合成。Anti-BC05162 抗體購自Abcam。C57BL/6J 小鼠購自南京動物模式研究。實驗經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

二、小鼠各組織及各發(fā)育階段睪丸總RNARNA提取

取成年小鼠5只，分別提取各組織的總 RNA（睪丸、附睪、膀胱、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、心臟、大腦）。分別取1周、2周、3周、4周、8周和6 個月小鼠睪丸組織，每個時間點的小鼠數(shù)量為5只，按照RNA 抽提試劑盒說明書抽提總 RNA。

三、RT-PCRT-PCR

用紫外分光光度儀對提取的總RNA 進行定量后，取1μg總RNA按照試劑盒說明書（ RR047A, akara, Dalian, Japan ）進行逆轉(zhuǎn)錄（ reverse ranscription，RT ）。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（ cDNA ）進行CR 反應(yīng)。在20μL反應(yīng)總體積加入：cDNA 1μL，CR Master Mix 10μL，正、反向引物（ 20 μmol ）共1.0μL，滅菌水8μL。PCR 擴增條件如下：98 ?C預(yù)變性2 min，98 ?C變性10 s，55 ?C退火30 s，72 ?C延伸30 s，共32個循環(huán)，72 ?C延伸5 min，4 ?C冷卻30 min，反應(yīng)結(jié)束后置4 ?C保存。2.5 %瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。Gapdh 為內(nèi)參對照，引物序列見（表 1）。

表1 基因引物信息

四、Real-time PCRe PCR

按照SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Kit說明書，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 作為模版在Light Cycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進行Real-time PCR反應(yīng)。 反應(yīng)體系為：模版cDNA 1μL，SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Mix 10μL，正、反向引物（20 μmol）共1.6μL，加RNase-free water 7.4μL至總體積20μL。反應(yīng)條件為: 95 ?C 30s，隨后95 ?C 5 s，55 ?C 30 s，72 ?C 15 s 共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析， 以Gapdh作為內(nèi)參進行標準化處理，采用ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)[9]。

五、蛋白免疫印跡法（Western blot blot）

將提取好的成年小鼠各個組織蛋白使用BCA定量試劑盒定量到2 μg/μL，按比例加入5 × SDS上樣緩沖液，100 ?C加熱10 min，制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量20 μL，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入anti-BC051628兔多克隆抗體（ab84944，1:500稀釋），4 ?C過夜孵育抗兔二抗（ab6721，1:10 000稀釋）室溫孵育1h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，于室溫下自然風干，掃描儀掃描結(jié)果保存。

六、免疫組化

睪丸石蠟切片脫蠟后用0.25% 過氧化氫液處理15min，經(jīng)山羊血清于37?C處理30min, 加anti-BC051628兔多克隆抗體，后置于4?C冰箱過夜，再加入生物素標記的二抗（SPTM試劑盒 ZYMED）在37?C，60 min 后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，孵育30 min，DAB顯色約1min。以上各步間均用PBS 沖洗，陰性對照用PBS 替代一抗。

七、生物信息學分析

小鼠BC051628蛋白氨基酸序列來自（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）。蛋白理化性質(zhì)分析使用（http://web.expasy.org/protparam/）。多序列同源性比較采用（http://www.ebi.ac.uk./Tools/msa/clustalw2/）。蛋白亞細胞定位采用（http://www.psort.org/）。

結(jié) 果

一、 BC05162851628 在成年小鼠各個不同組織中的RT-PCRT-PCR 結(jié)果分析

成年小鼠各個不同組織（ 睪丸、附睪、膀胱、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、心臟、大腦，骨骼肌 ）RTPCR 結(jié)果（圖 1）表明，BC051628基因特異性表達于小鼠睪丸組織；內(nèi)參 Gapdh 在各個組織穩(wěn)定表達。

圖 1 BC05162851628 基因在成年C57BL/6JBL/6J小鼠各個不同組織中的RT-PCRT-PCR結(jié)果

二、BC05162851628 在成年小鼠各個不同組織中的Western blot blot結(jié)果分析

成年小鼠各個不同組織（睪丸、附睪、膀胱、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、心臟、大腦，骨骼?。﹚estern blot 結(jié)果（圖 2）表明，BC051628蛋白呈現(xiàn)睪丸特異性表達；內(nèi)參GAPDH 在各個組織穩(wěn)定表達。

圖 2 BC051628蛋白在成年C57BBLL//66JJ小鼠各個不同組織中的Western bblloott結(jié)果

三、BC05162851628 在小鼠不同周齡睪丸組織中的RT RT 及 Real-time PCR PCR 結(jié)果分析

1周、2周、3周、4周、8周和6個月小鼠睪丸組織 RT (A) 及 Real-time PCR (B) 結(jié)果（圖3）表明，小鼠BC051628 基因在出生后2周內(nèi)睪丸組織中基本不表達，從出生后第2周開始出現(xiàn)持續(xù)性高表達，成年時表達量達到最高；內(nèi)參 Gapdh在不同周齡小鼠睪丸均穩(wěn)定表達。BC051628 基因在小鼠睪丸發(fā)育過程中成年齡依耐性表達，說明該基因與精子發(fā)生過程密切相關(guān)。

圖 3 BC05162851628 基因在 C57BL/6JBL/6J 小鼠不同周齡睪丸組織中的 RT-PCRT-PCR

四、 BC05162851628蛋白在小鼠不同周齡睪丸組織中的免疫組化結(jié)果分析

1周、2周、3周、4周、8周和6個月小鼠睪丸組織免疫組化結(jié)果（圖4）表明，小鼠BC051628 蛋白在出生后2周內(nèi)睪丸組織中基本不表達，從出生后第三周開始出現(xiàn)持續(xù)性高表達；BC051628蛋白主要定位于精原細胞、精母細胞及圓形精子。

五、小鼠BC05162851628 基因生物信息學分析

BC051628 基因全長6742 bp, 定位于小鼠2號染色體 H4 區(qū) ；有2種不同的轉(zhuǎn)錄本，其中轉(zhuǎn)錄本1（ ENSMUST00000050026 ）編碼 326 個氨基酸（ENSMUSP00000066320 ）；小鼠BC051628蛋白有326 個氨基酸，理論相對分子質(zhì)量為 37 kDa，理論等電點 PI 為6.27。BC051628 蛋白經(jīng)生物學信息學分析定位于細胞核。人與小鼠 BC051628 蛋白同源性分析表示：該蛋白氨基酸序列呈高度相似性（圖5），提示該基因在哺乳動物進化過程中十分保守。

圖4 BC05511662288蛋白在 C57BL/6J 小鼠不同周齡睪丸組織中的免疫組化結(jié)果Bar = 50μm

圖5 小鼠和人 BC05162851628蛋白同源性分析

討 論

近年來男性不育的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢，然而引起男性不育的病因至今仍未完全明了，多種因素可導致男性不育，包括藥物、內(nèi)分泌、免疫、感染、創(chuàng)傷等。遺傳缺陷和基因的改變與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)[10]。精子發(fā)生過程中一些體細胞表達的結(jié)構(gòu)基因靜止，而一系列睪丸生精細胞特異的基因持續(xù)表達[11]。目前大部分睪丸生精細胞特異的基因的功能尚不清楚，這些基因與男性不育的關(guān)系仍有待闡明。

哺乳動物的精子發(fā)生是一個極其復雜的過程，在哺乳動物中精原細胞轉(zhuǎn)變成精子需經(jīng)歷一系列復雜事件，包括：有絲分裂、減數(shù)分裂及細胞分化[12]。減數(shù)分裂在小鼠出生后第 11天開始，第15天粗線期精母細胞約占生精上皮細胞總數(shù)的1/3左右，第18天第一次減數(shù)分裂完成，第21天第二次減數(shù)分裂完成，即可在生精小管中見到圓形精子細胞[13]。在小鼠出生后的35～38d之間是其圓形精子向長形精子轉(zhuǎn)化的變態(tài)過程。 本研究分析的BC051628基因在小鼠睪丸組織中特異性表達，其在2l d齡睪丸之前不表達，在28d 齡及6月齡小鼠睪丸中持續(xù)高表達。上述結(jié)果表明 BC051628 基因的表達與小鼠精子發(fā)生過程基本一致。

BC051628基因全長6742 bp，定位于小鼠2號染色體 H4區(qū)，編碼326個氨基酸。BC051628只表達于小鼠睪丸組織，并呈現(xiàn)明顯年齡依耐性，說明該基因與精子發(fā)生過程密切相關(guān)。BC051628蛋白在睪丸中主要定位于精原細胞、精母細胞及圓形精子。經(jīng)生物信能息學分析發(fā)現(xiàn)BC051628蛋白主要定位于細胞核，其編碼蛋白在小鼠與人中呈現(xiàn)高度同源性，提示該基因在哺乳動物進化過程中十分保守。

本實驗采用RT-PCR及Western blot等方法第一次證明BC051628屬于睪丸特異性基因。目前，確定BC051628基因的蛋白質(zhì)表達特點及其功能正在我們實驗室里進行。這些研究工作的順利開展，將為解釋BC051628在精子發(fā)生過程中確切功能提供實驗證據(jù)。

參 考 文 獻

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（2014-10-24收稿）

**通訊作者, Tel: 0755-83923333-3320; E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.002

中圖分類號R 349.6; R 698.2

*基金項目資助: 國家自然科學基金資助項目（31271244 和 31471344）; 深圳市科技計劃重點項目（XB201104220045A 和 JCYJ20140415162543017）

Expression and bioinformation analysis of a testis-specific gene BC051628 in mice＊

Li Yuchi1, 2, Lin Shouren1, Luo Manling1,2, Guo Huan1,3, Wu Hanwei4, Jiang Zhimao1, Gui Yaoting1**
1. The Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, 518036, China; 2. Shantou University Medical College; 3. Guangzhou Medical University; 4. The Second People's Hospital of Shenzhen
Corresponding author: Gui Yaoting, Tel: 0755-83923333-3320; E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com

AbstractObjective To identify the expression characteristic of BC051628 (cDNA sequence BC051628) gene in mice. Methodsthods A new testis-specifi c gene BC051628 was identifi ed in mice by gene expression profi le analysis. The expressions of BC051628 in different tissues and developmental stage of testes in mice were further validated by real-time PCR, western blot and immunohistochemistry. The related bioinformation analysis were done using bioinformatics software. Resultssults BC051628 were exclusively expressed in testes in an age-dependent manner. The protein of this gene was mainly expressed in spermatogonia, spermatocytes and round spermatids. Bioinformatics analysis showed that BC051628 protein amino acid sequences had a high degree of similarity between human and mice, which indicated that this gene was highly conserved in mammals. Conclusionusion BC051628 is a testis-specifi c gene, might play an important role in spermatogenesis.

Key wordsords genes; testis; computational biology; spermatogenesis