李俞池林首任羅滿玲郭 煥, 3吳漢偉江智茂桂耀庭**. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院, 深圳市男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（深圳 58036）;2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 3. 廣州醫(yī)科大學(xué); . 深圳市第二人民醫(yī)院

·論 著·

睪丸特異性基因BC05162851628在小鼠中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析*

李俞池1, 2林首任1羅滿玲1, 2郭 煥1, 3吳漢偉4江智茂1桂耀庭1**
1. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院, 深圳市男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（深圳 518036）;
2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 3. 廣州醫(yī)科大學(xué); 4. 深圳市第二人民醫(yī)院

摘要目的 研究睪丸特異性基因BC051628在小鼠中的表達(dá)特征。方法 通過分析小鼠基因表達(dá)譜芯片，發(fā)現(xiàn) BC051628基因特異性表達(dá)于睪丸組織。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）、蛋白免疫印跡法（Western blot）及免疫組化等方法分析該基因在小鼠不同組織及睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)特征。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果 BC051628基因在小鼠各組織中呈現(xiàn)睪丸特異性表達(dá)并伴隨明顯年齡依耐性。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)BC051628蛋白主要定位于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及圓形精子。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)BC051628基因編碼蛋白氨基酸序列在人和小鼠具有高度同源性，提示該基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中十分保守。結(jié)論 BC051628屬于睪丸特異性基因，可能在生精過程發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞基因; 睪丸; 計(jì)算生物學(xué); 精子發(fā)生

睪丸是人體重要的生殖器官，睪丸中精子正常發(fā)生是人類繁衍的基礎(chǔ)。精子發(fā)生（spermatogenesis）是一個(gè)非常復(fù)雜且有序的過程，它涉及到多種睪丸特異性基因在不同時(shí)間和空間的先后表達(dá)及相互作用，例如：Cerm[1]，Dmc1[2]，Hist1h1t[3]，Cdc2[4]，np1[5]等。因此研究這些基因的表達(dá)特征及功能，對(duì)掌握精子發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制及闡明男性生精障礙具有重要作用[6]。

基因表達(dá)譜芯片作為基因表達(dá)信息的重要數(shù)據(jù)庫，在基因識(shí)別、繪制基因表達(dá)圖譜、尋找新基因等研究領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[7]。目前美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫（GEO DataSets）已經(jīng)擁有30余萬條小鼠睪丸基因表達(dá)數(shù)據(jù)記錄[8]，為尋找小鼠睪丸特異性新基因提供了基礎(chǔ)。我們實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)小鼠基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn) BC051628 基因特異性表達(dá)于睪丸。進(jìn)而通過采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）等實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)，BC051628屬于睪丸特異性基因。經(jīng)生物信息學(xué)分析，BC051628基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中十分保守。該基因發(fā)現(xiàn)為研究精子發(fā)生提供了一個(gè)新的候選基因。

材料與方法

一、材料

總 RNA 抽提試劑 Trizol 購(gòu)自 Invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara 生物公司。PCR 擴(kuò)增引物由 Invitrogen 廣州公司合成。Anti-BC05162 抗體購(gòu)自Abcam。C57BL/6J 小鼠購(gòu)自南京動(dòng)物模式研究。實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、小鼠各組織及各發(fā)育階段睪丸總RNARNA提取

取成年小鼠5只，分別提取各組織的總 RNA（睪丸、附睪、膀胱、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、心臟、大腦）。分別取1周、2周、3周、4周、8周和6 個(gè)月小鼠睪丸組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠數(shù)量為5只，按照RNA 抽提試劑盒說明書抽提總 RNA。

三、RT-PCRT-PCR

用紫外分光光度儀對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行定量后，取1μg總RNA按照試劑盒說明書（ RR047A, akara, Dalian, Japan ）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（ reverse ranscription，RT ）。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（ cDNA ）進(jìn)行CR 反應(yīng)。在20μL反應(yīng)總體積加入：cDNA 1μL，CR Master Mix 10μL，正、反向引物（ 20 μmol ）共1.0μL，滅菌水8μL。PCR 擴(kuò)增條件如下：98 ?C預(yù)變性2 min，98 ?C變性10 s，55 ?C退火30 s，72 ?C延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)，72 ?C延伸5 min，4 ?C冷卻30 min，反應(yīng)結(jié)束后置4 ?C保存。2.5 %瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。Gapdh 為內(nèi)參對(duì)照，引物序列見（表 1）。

表1 基因引物信息

四、Real-time PCRe PCR

按照SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Kit說明書，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 作為模版在Light Cycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。 反應(yīng)體系為：模版cDNA 1μL，SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Mix 10μL，正、反向引物（20 μmol）共1.6μL，加RNase-free water 7.4μL至總體積20μL。反應(yīng)條件為: 95 ?C 30s，隨后95 ?C 5 s，55 ?C 30 s，72 ?C 15 s 共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 以Gapdh作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)[9]。

五、蛋白免疫印跡法（Western blot blot）

將提取好的成年小鼠各個(gè)組織蛋白使用BCA定量試劑盒定量到2 μg/μL，按比例加入5 × SDS上樣緩沖液，100 ?C加熱10 min，制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量20 μL，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入anti-BC051628兔多克隆抗體（ab84944，1:500稀釋），4 ?C過夜孵育抗兔二抗（ab6721，1:10 000稀釋）室溫孵育1h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，于室溫下自然風(fēng)干，掃描儀掃描結(jié)果保存。

六、免疫組化

睪丸石蠟切片脫蠟后用0.25% 過氧化氫液處理15min，經(jīng)山羊血清于37?C處理30min, 加anti-BC051628兔多克隆抗體，后置于4?C冰箱過夜，再加入生物素標(biāo)記的二抗（SPTM試劑盒 ZYMED）在37?C，60 min 后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，孵育30 min，DAB顯色約1min。以上各步間均用PBS 沖洗，陰性對(duì)照用PBS 替代一抗。

七、生物信息學(xué)分析

小鼠BC051628蛋白氨基酸序列來自（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）。蛋白理化性質(zhì)分析使用（http://web.expasy.org/protparam/）。多序列同源性比較采用（http://www.ebi.ac.uk./Tools/msa/clustalw2/）。蛋白亞細(xì)胞定位采用（http://www.psort.org/）。

結(jié) 果

一、 BC05162851628 在成年小鼠各個(gè)不同組織中的RT-PCRT-PCR 結(jié)果分析

成年小鼠各個(gè)不同組織（ 睪丸、附睪、膀胱、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、心臟、大腦，骨骼肌 ）RTPCR 結(jié)果（圖 1）表明，BC051628基因特異性表達(dá)于小鼠睪丸組織；內(nèi)參 Gapdh 在各個(gè)組織穩(wěn)定表達(dá)。

圖 1 BC05162851628 基因在成年C57BL/6JBL/6J小鼠各個(gè)不同組織中的RT-PCRT-PCR結(jié)果

二、BC05162851628 在成年小鼠各個(gè)不同組織中的Western blot blot結(jié)果分析

成年小鼠各個(gè)不同組織（睪丸、附睪、膀胱、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、心臟、大腦，骨骼肌）western blot 結(jié)果（圖 2）表明，BC051628蛋白呈現(xiàn)睪丸特異性表達(dá)；內(nèi)參GAPDH 在各個(gè)組織穩(wěn)定表達(dá)。

圖 2 BC051628蛋白在成年C57BBLL//66JJ小鼠各個(gè)不同組織中的Western bblloott結(jié)果

三、BC05162851628 在小鼠不同周齡睪丸組織中的RT RT 及 Real-time PCR PCR 結(jié)果分析

1周、2周、3周、4周、8周和6個(gè)月小鼠睪丸組織 RT (A) 及 Real-time PCR (B) 結(jié)果（圖3）表明，小鼠BC051628 基因在出生后2周內(nèi)睪丸組織中基本不表達(dá)，從出生后第2周開始出現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)，成年時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高；內(nèi)參 Gapdh在不同周齡小鼠睪丸均穩(wěn)定表達(dá)。BC051628 基因在小鼠睪丸發(fā)育過程中成年齡依耐性表達(dá)，說明該基因與精子發(fā)生過程密切相關(guān)。

圖 3 BC05162851628 基因在 C57BL/6JBL/6J 小鼠不同周齡睪丸組織中的 RT-PCRT-PCR

四、 BC05162851628蛋白在小鼠不同周齡睪丸組織中的免疫組化結(jié)果分析

1周、2周、3周、4周、8周和6個(gè)月小鼠睪丸組織免疫組化結(jié)果（圖4）表明，小鼠BC051628 蛋白在出生后2周內(nèi)睪丸組織中基本不表達(dá)，從出生后第三周開始出現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)；BC051628蛋白主要定位于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及圓形精子。

五、小鼠BC05162851628 基因生物信息學(xué)分析

BC051628 基因全長(zhǎng)6742 bp, 定位于小鼠2號(hào)染色體 H4 區(qū) ；有2種不同的轉(zhuǎn)錄本，其中轉(zhuǎn)錄本1（ ENSMUST00000050026 ）編碼 326 個(gè)氨基酸（ENSMUSP00000066320 ）；小鼠BC051628蛋白有326 個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為 37 kDa，理論等電點(diǎn) PI 為6.27。BC051628 蛋白經(jīng)生物學(xué)信息學(xué)分析定位于細(xì)胞核。人與小鼠 BC051628 蛋白同源性分析表示：該蛋白氨基酸序列呈高度相似性（圖5），提示該基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中十分保守。

圖4 BC05511662288蛋白在 C57BL/6J 小鼠不同周齡睪丸組織中的免疫組化結(jié)果Bar = 50μm

圖5 小鼠和人 BC05162851628蛋白同源性分析

討 論

近年來男性不育的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，然而引起男性不育的病因至今仍未完全明了，多種因素可導(dǎo)致男性不育，包括藥物、內(nèi)分泌、免疫、感染、創(chuàng)傷等。遺傳缺陷和基因的改變與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)[10]。精子發(fā)生過程中一些體細(xì)胞表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因靜止，而一系列睪丸生精細(xì)胞特異的基因持續(xù)表達(dá)[11]。目前大部分睪丸生精細(xì)胞特異的基因的功能尚不清楚，這些基因與男性不育的關(guān)系仍有待闡明。

哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，在哺乳動(dòng)物中精原細(xì)胞轉(zhuǎn)變成精子需經(jīng)歷一系列復(fù)雜事件，包括：有絲分裂、減數(shù)分裂及細(xì)胞分化[12]。減數(shù)分裂在小鼠出生后第 11天開始，第15天粗線期精母細(xì)胞約占生精上皮細(xì)胞總數(shù)的1/3左右，第18天第一次減數(shù)分裂完成，第21天第二次減數(shù)分裂完成，即可在生精小管中見到圓形精子細(xì)胞[13]。在小鼠出生后的35～38d之間是其圓形精子向長(zhǎng)形精子轉(zhuǎn)化的變態(tài)過程。 本研究分析的BC051628基因在小鼠睪丸組織中特異性表達(dá)，其在2l d齡睪丸之前不表達(dá)，在28d 齡及6月齡小鼠睪丸中持續(xù)高表達(dá)。上述結(jié)果表明 BC051628 基因的表達(dá)與小鼠精子發(fā)生過程基本一致。

BC051628基因全長(zhǎng)6742 bp，定位于小鼠2號(hào)染色體 H4區(qū)，編碼326個(gè)氨基酸。BC051628只表達(dá)于小鼠睪丸組織，并呈現(xiàn)明顯年齡依耐性，說明該基因與精子發(fā)生過程密切相關(guān)。BC051628蛋白在睪丸中主要定位于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及圓形精子。經(jīng)生物信能息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)BC051628蛋白主要定位于細(xì)胞核，其編碼蛋白在小鼠與人中呈現(xiàn)高度同源性，提示該基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中十分保守。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR及Western blot等方法第一次證明BC051628屬于睪丸特異性基因。目前，確定BC051628基因的蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn)及其功能正在我們實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行。這些研究工作的順利開展，將為解釋BC051628在精子發(fā)生過程中確切功能提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2014-10-24收稿）

**通訊作者, Tel: 0755-83923333-3320; E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.002

中圖分類號(hào)R 349.6; R 698.2

*基金項(xiàng)目資助: 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271244 和 31471344）; 深圳市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（XB201104220045A 和 JCYJ20140415162543017）

Expression and bioinformation analysis of a testis-specific gene BC051628 in mice＊

Li Yuchi1, 2, Lin Shouren1, Luo Manling1,2, Guo Huan1,3, Wu Hanwei4, Jiang Zhimao1, Gui Yaoting1**
1. The Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, 518036, China; 2. Shantou University Medical College; 3. Guangzhou Medical University; 4. The Second People's Hospital of Shenzhen
Corresponding author: Gui Yaoting, Tel: 0755-83923333-3320; E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com

AbstractObjective To identify the expression characteristic of BC051628 (cDNA sequence BC051628) gene in mice. Methodsthods A new testis-specifi c gene BC051628 was identifi ed in mice by gene expression profi le analysis. The expressions of BC051628 in different tissues and developmental stage of testes in mice were further validated by real-time PCR, western blot and immunohistochemistry. The related bioinformation analysis were done using bioinformatics software. Resultssults BC051628 were exclusively expressed in testes in an age-dependent manner. The protein of this gene was mainly expressed in spermatogonia, spermatocytes and round spermatids. Bioinformatics analysis showed that BC051628 protein amino acid sequences had a high degree of similarity between human and mice, which indicated that this gene was highly conserved in mammals. Conclusionusion BC051628 is a testis-specifi c gene, might play an important role in spermatogenesis.

Key wordsords genes; testis; computational biology; spermatogenesis