王　蕾　王純雁

作者單位：110042 遼寧省腫瘤醫(yī)院婦科

苦參堿及聯(lián)合順鉑對宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)的影響

王蕾王純雁

作者單位：110042 遼寧省腫瘤醫(yī)院婦科

【摘要】目的探討苦參堿及聯(lián)合順鉑對宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)的影響。方法以人宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞株為試驗材料，采取甲基偶氮唑藍(lán)法檢測并計算細(xì)胞抑制率。采取實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)法分析TSLC1 mRNA基因表達(dá)情況。結(jié)果順鉑、苦參堿聯(lián)合順鉑均可顯著抑制SiHa細(xì)胞體外增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著用藥濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，不同濃度兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞抑制率高于苦參組、順鉑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。三組用藥后，TSLC1基因表達(dá)水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著濃度的增加，影響效果更強(qiáng)，組間不同濃度兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組高于順鉑組、苦參堿組，同濃度比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組與苦參堿組同濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論苦參堿及聯(lián)合順鉑對宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)有抑制作用，且與藥物濃度呈劑量依賴性。

【關(guān)鍵詞】苦參堿；順鉑；宮頸癌；SiHa細(xì)胞；TSLC1基因

Effects of Matrine Combined with Cisplatin on the Expression of TSLC1 Gene in Human Cervical Cancer SiHa Cell

WANGlei，WANGChunyan.LiaoningTumorHospital，Shenyang，110042

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of matrine combined with cisplatin on the expression of TSLC1 gene in human cervical cancer SiHa cell.MethodsHuman cervical cancer SiHa cell were selected as the experimental material，the inhibition rate was tested by MTT，the expression of TSLC1 gene were tested by RT-PCR.ResultsThe matrine combined with cisplatin can inhibit proliferation of SiHa cell in vitro(P<0.05)；The inhibitory effect in high concentration was higher than that of the lower concentration(P<0.05)；The inhibition rate of the combined group was higher than matrine group and cisplatin group(P<0.05)；The TSLC1 gene expression of the 3 groups was higher than that of the control group(P<0.05)；The inhibitory effect in high concentration were higher than that of the lower concentration(P<0.05)；The combined group was higher than the matrine group and cisplatin group(P<0.05)；There was no significant difference between matrine group and cisplatin group(P>0.05).ConclusionMatrine combined with cisplatin has inhibitory effect on the expression of TSLC1 gene in human cervical cancer SiHa Cell，and the effect is dose dependent.

【Key words】Matrine；Cisplatin；Cervical cancer；SiHa Cell；TSLC1 Gene

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0326～0328)

宮頸癌臨床發(fā)病率較高，是僅次于乳腺癌的婦科惡性腫瘤，死亡率居女性惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展受多因素、多階段、多基因共同影響，其中癌基因激活、抑癌基因失活以及抑癌基因表達(dá)下降或缺失所引起的細(xì)胞異常增生和凋亡失控是引發(fā)癌癥的主要危險因素[2]。因此，研究與宮頸癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的各種抑癌基因及其與治療藥物之間的關(guān)系對宮頸癌的臨床治療具有重要意義?，F(xiàn)對苦參堿及聯(lián)合順鉑對宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)的影響情況進(jìn)行分析，以期為臨床治療提供參考，報告如下。

1材料與方法

1.1　材料

人宮頸癌細(xì)胞株：SiHa細(xì)胞株(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2　主要試劑及儀器

試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(購于美國Gibco公司)；FBS(購自杭州四季青公司)；DMSO(購自北京索萊寶科技有限公司)；胰蛋白酶(購自美國Sigma公司)；MTT(購自美國Amresco)公司。

儀器：超凈工作臺；顯微鏡；酶標(biāo)分析儀；電子天平；恒溫水浴箱；離心機(jī)；震蕩儀；移液器。

1.3　方法

MTT(甲基偶氮唑藍(lán))法：選取對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，制備細(xì)胞懸液；37℃下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁完成后，分別加入不同濃度的順鉑，做6個平行孔?？鄥A濃度為：0 μg/ml(對照)，50 μg/ml(濃度1)，100 μg/ml(濃度2)，150 μg/ml(濃度3)，200 μg/ml(濃度4)，250 μg/ml(濃度5)；順鉑濃度為：0 μg/ml(對照)，5 μg/ml(濃度1)，10 μg/ml(濃度2)，15 μg/ml(濃度3)，20 μg/ml(濃度4)，25 μg/ml(濃度5)；苦參堿聯(lián)合順鉑濃度為：苦參堿0 μg/ml(對照)、50 μg/ml(濃度1)、100 μg/ml(濃度2)、150 μg/ml(濃度3)、200 μg/ml(濃度4)、250 μg/ml(濃度5)，分別聯(lián)合15 μg/ml順鉑。同樣，選取細(xì)胞后，培養(yǎng)，貼壁完成，分別加入不同濃度的苦參，做6個平行孔。在上述條件下對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)。加入MTT10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去培養(yǎng)液，加入DMSO終止反應(yīng)；測定吸光值。計算細(xì)胞抑制率。

RT-PCR(實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng))法[3]：選取MTT結(jié)果中最佳抑制率對應(yīng)的時間為聯(lián)合組，其他為苦參堿組(加入不同濃度苦參堿)、順鉑組(加入不同濃度順鉑)，選擇未經(jīng)順鉑和苦參堿處理的SiHa細(xì)胞為對照組?；驹恚涸赑CR反應(yīng)體系中，加入過量的熒光染料后，使其和雙鏈DNA特異性結(jié)合，進(jìn)而發(fā)出熒光信號，判斷擴(kuò)增結(jié)果。具體方法：設(shè)計引物；RNA提取；cDNA(反轉(zhuǎn)錄NDA)的合成；RT-PCR反應(yīng)。

1.4　結(jié)果判斷

細(xì)胞體外增殖情況：采取酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測定吸光值。對照組細(xì)胞體外生長狀態(tài)良好，以其細(xì)胞活力為100%，計算不同濃度順鉑對細(xì)胞體外增殖的影響(抑制率)[4]。

TSLC1 mRNA基因表達(dá)情況：根據(jù)循環(huán)后的熒光信號，得到不同組間的TSLC1 mRNA基因相對表達(dá)量。

1.5　統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1　苦參堿聯(lián)合順鉑對SiHa細(xì)胞體外增殖的影響

苦參堿聯(lián)合順鉑對SiHa細(xì)胞體外增殖的影響見表1。結(jié)果表明，對照組細(xì)胞生長良好，增殖效果明顯；聯(lián)合組、苦參堿組、順鉑組細(xì)胞生長狀態(tài)不佳，多死亡，苦參堿、順鉑、苦參堿聯(lián)合順鉑均可顯著抑制SiHa細(xì)胞體外增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著用藥濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，組間不同濃度兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞抑制率高于苦參組、順鉑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1　不同濃度苦參堿、順鉑及苦參堿聯(lián)合順鉑對SiHa細(xì)胞體外增殖的抑制情況 /%

注：a為與同組前一個濃度比較，P<0.05；b為與苦參堿組比較，P<0.05；c為與順鉑組比較，P<0.05。

2.2　實時變光定量RT-PCR測定結(jié)果

不同濃度苦參堿、順鉑及苦參堿聯(lián)合順鉑48 h后對TSLC1基因mRNA表達(dá)水平的影響見表2。結(jié)果表明，三組用藥后，TSLC1基因表達(dá)水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著濃度的增加，影響效果增強(qiáng)，組間不同濃度兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組高于順鉑組、苦參堿組，同濃度比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組與苦參堿組同濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3　實時突光定量RT-PCR特異性驗證

實時突光定量RT-PCR特異性驗證結(jié)果表明，SLC1基因溶解曲線為單峰，未出現(xiàn)引物的二聚體擴(kuò)增和非特異性擴(kuò)增。對引物同時進(jìn)行實時突光定量RT-PCR檢測，結(jié)果表明引物的特異性良好。

表2　不同濃度苦參堿、順鉑及苦參堿聯(lián)合順鉑對TSLC1基因mRNA表達(dá)水平的影響±s)

注：a為與前一個濃度比較，P<0.05，b為與對照組比較，P<0.05。

3討論

宮頸癌是女性惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率。研究有效的控制措施對于提高預(yù)后具有重要意義。流行病學(xué)研究認(rèn)為，宮頸癌的發(fā)病和患者性伴侶多、性行為早、吸煙等有直接的關(guān)系[5]。而且該病癥的發(fā)病還和經(jīng)濟(jì)社會因素、地理環(huán)境因素等有關(guān)系。其中，以HR-HPV(高危型人乳頭狀瘤病毒)感染較嚴(yán)重[6]。該病毒在多數(shù)宮頸癌患者體內(nèi)均存在，但感染該病毒并不是一定會發(fā)展為宮頸癌[7]。宮頸癌的發(fā)生時癌基因和抑癌基因共同作用的結(jié)果。一般情況下，人們根據(jù)其病癥特點，將其分為三級預(yù)防，分別預(yù)防不同程度的病癥感染[8]。

宮頸癌是對女性生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響的病癥之一，該病癥具有較長的發(fā)展期，細(xì)胞學(xué)篩查是預(yù)防該病癥的重要手段，其中，以巴氏染色、宮頸液基細(xì)胞學(xué)篩查為主要手段[9]。早期預(yù)防和治療宮頸癌對降低患者死亡率、節(jié)約費(fèi)用具有重要意義。

TSLC1(tumor suppressor in lung cancer-1，肺癌腫瘤因子)是1種新的腫瘤抑制因子，在人體組織中廣泛表達(dá)，具有較高的細(xì)胞黏附功能，作為1種抑癌基因，能夠和細(xì)胞之間相互黏附，發(fā)揮抑制效果[10]。TSLC1基因的表達(dá)和缺失，和宮頸癌、肺癌等由一定的相關(guān)性。病理學(xué)研究認(rèn)為，患者在腫瘤發(fā)病晚期，TSLC1基因失活明顯[11]。TSLC1基作為1種腫瘤抑制因子，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均有參與[12]。

惡性腫瘤的發(fā)展可分為三步，首先是癌細(xì)胞脫離癌組織，然后是癌細(xì)胞經(jīng)血液、淋巴系統(tǒng)等移動，最后是癌細(xì)胞在遠(yuǎn)離原發(fā)灶的地方種植和生長[13]。TSLC1基因在宮頸癌組織中存在，參與了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的全過程[14]。現(xiàn)階段，中藥治療腫瘤是醫(yī)學(xué)研究的新方向，部分中藥能夠抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，較低的副作用，治療效果較好[15]?？鄥A具有免疫調(diào)節(jié)等多種藥理功能，其抗腫瘤效果正被不斷研究[16]。

本文研究結(jié)果顯示，順鉑、苦參堿聯(lián)合順鉑均可顯著抑制SiHa細(xì)胞體外增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著用藥濃度的增加，抑制效果加大，組間不同濃度兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞抑制率高于苦參組、順鉑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。三組用藥后，TSLC1基因的表達(dá)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著濃度的增加，影響效果加大，組間不同濃度兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組高于順鉑組、苦參堿組，同濃度比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組與苦參堿組同濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此，苦參堿及聯(lián)合順鉑對宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)有抑制作用，且對藥物濃度呈劑量依賴性。

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(編輯：吳小紅)

(收稿日期2014-11-05修回日期 2015-01-29)

中圖分類號：R730.53

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)03-0326-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.03.004

通訊作者：王純雁