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作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院(郭昌瑩，匡?？?；8528523 日本國(guó)立長(zhǎng)崎大學(xué)干細(xì)胞研究室(李桃生)

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PKM2基因?qū)D44+肺癌干細(xì)胞增殖及耐藥性的影響

郭昌瑩匡?？道钐疑?/p>

作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院(郭昌瑩，匡?？?；8528523 日本國(guó)立長(zhǎng)崎大學(xué)干細(xì)胞研究室(李桃生)

【摘要】目的觀察轉(zhuǎn)染后CD44+肺癌干細(xì)胞內(nèi)PKM2 基因的表達(dá)變化及其對(duì)CD44+肺癌干細(xì)胞增殖、耐藥性的影響。方法將A549肺癌細(xì)胞株繼代培養(yǎng)后，采取免疫磁珠細(xì)胞分選法，通過(guò)AutoMACS儀器，分選出CD44+細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，將人工合成的針對(duì)PKM2 基因的siRNA 片段通過(guò)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitativePCR，qRT-PCR)和Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞中PKM2 的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量，細(xì)胞免疫組化染色分析CD44及PKM2表達(dá)，并采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力。藥性敏感性試驗(yàn)：在培養(yǎng)基內(nèi)添加不同濃度化療藥物DDP，并通過(guò)MTT assay測(cè)試細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖速度。結(jié)果CD44+肺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA 后，CD44+肺癌干細(xì)胞中PKM2 mRNA及蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)，細(xì)胞增殖能力減弱，抗腫瘤藥物耐藥性降低。結(jié)論P(yáng)KM2對(duì)CD44+肺癌干細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用，同時(shí)具有增強(qiáng)抗腫瘤藥物耐藥性的作用。

【關(guān)鍵詞】肺癌干細(xì)胞；PKM2；增殖；耐藥性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:641～644)

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它有4種同工酶分別是M1型、M2型、L型、R型。近年來(lái)，研究都集中在丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)上，在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)并在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起重要的作用[1]。有研究在肺癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[4-5]和結(jié)、直腸癌[6]等多種腫瘤中PKM2 的表達(dá)明顯增高，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)檢測(cè)CD44+肺癌干細(xì)胞中PKM2 的表達(dá)，探討PKM2 在CD44+肺癌干細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)增殖和耐藥性的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株A549肺癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2主要儀器PCR 儀(Bio-Rad)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad)、Western blot 儀(Bio-Rad)，流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur System)，AutoMACS儀器(Miltenyi Biotec)。

1.1.3主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FCS，美國(guó)Gibico公司)DMSO、Trizol試劑、opti-MEM、Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，CD44 Microbeads及CD44抗體(美國(guó)Miltenyi Biotec公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix、蛋白定量試劑盒、PKM2兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Cell Signal Technology公司)，β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)，Western blot 二抗試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，PKM2siRNA由美國(guó)Santa Cruz公司設(shè)計(jì)并合成，并同時(shí)合成帶熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA。PKM2干擾序列5-GCUGUGGCUCUAGACACUATT-3′;5′-UAGUGUCUAGAGCCACAGCTT-3′;陰性對(duì)照組干擾序5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。PCR引物由美國(guó)Santa Cruz公司合成PKM2 forward，5-CACCTgTACCgTggCATCTTC-3′；PKM2 reverse：5-gTCAgCACAATgACCACATCTC-3′。β-actin forward：5′-TggCACCCAgCACAATgAA-3′；β-actin reverse：5-CTAAgTCATAgTCCgCCTAgAAgCA-3′。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞繼代培養(yǎng)按普通的細(xì)胞繼代培養(yǎng)方法實(shí)施(詳略)。

1.2.2免疫磁珠細(xì)胞分選法將細(xì)胞與鼠抗人CD44抗體反應(yīng)，清洗后再與磁珠標(biāo)記二次抗體(兔抗鼠免疫球蛋白抗體)反應(yīng)，清洗后通過(guò)AutoMACS儀器，分選出CD44+細(xì)胞和CD44-陰性細(xì)胞。并用FITC熒光標(biāo)記抗CD44抗體確認(rèn)出其良好純度情況。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h分別取CD44+細(xì)胞和CD44-陰性細(xì)胞約3.0×105個(gè)接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)于含5% FCS不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液，次日觀察細(xì)胞密度約達(dá)70%～80%開始轉(zhuǎn)染。將Lipofectamine2000和PKM2 siRNA 按1∶4比例分別稀釋于400 μl的opti-MEM培養(yǎng)液中，5 min內(nèi)混勻，室溫避光孵育20 min后加入六孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)6 h后更換新鮮的含5%FCS不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞分別進(jìn)行qRT-PCR 和Western blot檢測(cè)。

1.2.4RNA提取按1×106個(gè)細(xì)胞分別加1 ml Trizol的量抽提細(xì)胞的總RNA，整個(gè)操作過(guò)程均在冰上進(jìn)行，提取的RNA測(cè)OD值。

1.2.5qRT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞mRNA表達(dá)量分別取2 μg總RNA、使用PKM2和內(nèi)參β-actin的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲得的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，后按95 ℃10 s、57 ℃30 s、65 ℃30 s 反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，并繪制溶解曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)計(jì)算各組中的PKM2表達(dá)量比值。

1.2.6Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，以每孔100 μg上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上，將膜置于封閉液中封閉1 h，加入1∶800稀釋的PKM2一抗4 ℃孵育過(guò)夜，過(guò)夜后用洗膜液洗3次各10 min，加入二抗孵育30 min，洗膜液洗3次各10 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯影直到紫色條帶顯出后用蒸餾水終止顯色，觀察結(jié)果。以β-actin 為內(nèi)參照，計(jì)算灰度值比值，作為其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7細(xì)胞免疫組化染色分析CD44及PKM2表達(dá)轉(zhuǎn)染前24 h分別取CD44+細(xì)胞約3.0×105個(gè)接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)于含5%FCS不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液，次日觀察細(xì)胞密度約達(dá)70%～80%開始轉(zhuǎn)染。將Lipofectamine2000和PKM2 siRNA按1∶4比例分別稀釋于400 μl的opti-MEM 培養(yǎng)液中，5 min內(nèi)混勻，室溫避光孵育20 min后加入六孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)6 h后更換新鮮的含5%FCS不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，分別進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色分析。

1.2.8MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性轉(zhuǎn)染前24 h胰酶消化收集細(xì)胞，接種于96孔板(每組4 孔)，細(xì)胞密度為每孔3×104，轉(zhuǎn)染步驟如上所述，24 h后每孔加入MTT20 μl，37 ℃孵育4 h后，棄上清液，在每孔加入100 μl的DMSO，避光振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算各組的平均值，以間接反映各組活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.9藥性敏感性試驗(yàn)轉(zhuǎn)染前24 h胰酶消化收集細(xì)胞，接種于96孔板(每組4孔)，細(xì)胞密度為每孔3×104，轉(zhuǎn)染步驟如上所述，24 h后在培養(yǎng)基內(nèi)添加濃度為0 μg/ml、1 μg/ml 、3 μg/ml 、5 μg/ml化療藥物DDP，24 h后每孔加入MTT20 μl，37 ℃孵育4 h后，棄上清液，在每孔加入100 μl的DMSO，避光振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算各組的平均值，以間接反映各組活細(xì)胞數(shù)量。

2結(jié)果

2.1免疫磁珠法分選出CD44+腫瘤干細(xì)胞

從A549細(xì)胞中分選出CD44+肺癌干細(xì)胞，并用FITC熒光標(biāo)記抗CD44抗體確認(rèn)出其良好純度。

2.2PKM2的轉(zhuǎn)染效率

細(xì)胞通過(guò)Lipofectamine2000 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA，分別于24 h、48 h、72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)間段幾乎所有轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核可以觀察到綠色熒光，也就是說(shuō)使用綠色熒光素標(biāo)記的干擾RNA轉(zhuǎn)染成功，證實(shí)PKM2 siRNA已轉(zhuǎn)入細(xì)胞并表達(dá)。

2.3細(xì)胞免疫組化染色分析CD44及PKM2表達(dá)

細(xì)胞免疫組化染色顯示：PKM2 蛋白表達(dá)水平明顯下降，CD44蛋白表達(dá)水平也呈不同程度下降。

2.4qRT-PCR 檢測(cè)PKM2 的表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的PKM2表達(dá)量分別為1.78和0.86。實(shí)驗(yàn)組中PKM2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，與對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1　qRT-PCR檢測(cè)PKM2的表達(dá)

2.5Western blot檢測(cè)PKM2蛋白水平的表達(dá)

Western blot檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組PKM2蛋白表達(dá)水平明顯降低，與對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2 。

圖2　Western blot檢測(cè)PKM2蛋白水平的表達(dá)

2.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平顯示，CD44+肺癌干細(xì)胞PKM2被干擾后，細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，在48 h實(shí)驗(yàn)組OD值明顯低于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.7藥性敏感性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，CD44+肺癌干細(xì)胞PKM2被干擾后，抗腫瘤藥物耐藥性降低，OD值差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖3　MTT法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h增殖能力

圖4　MTT法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h增殖能力

3討論

一般認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞起源于正常的組織干細(xì)胞[7]，并保有正常組織干細(xì)胞的部分特性，包括生存于氧濃度相對(duì)低下的組織環(huán)境中。目前用于辨別腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，例如CD44及CD133等，其實(shí)基本上都屬于常用的造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。其中CD44是糖基化的跨膜多肽鏈，作為細(xì)胞表面受體接受細(xì)胞外基質(zhì)糖基化、透明質(zhì)酸化信息的傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，CD44在部分肺癌細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，并與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，顯示了其作為肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物的妥當(dāng)性[8]。盡管腫瘤干細(xì)胞具有部分正常組織干細(xì)胞的基本特性，與正常的組織干細(xì)胞不同，腫瘤干細(xì)胞缺乏自穩(wěn)能力，導(dǎo)致無(wú)限制生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)化療藥物及放射線照射具有很強(qiáng)的抵抗能力。其原因或許與腫瘤干細(xì)胞保有獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，缺乏負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制等有關(guān)[9]，但有待于繼續(xù)研究證實(shí)。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要特征是糖代謝異常[10]，正常細(xì)胞只有在缺氧的情況下才發(fā)生糖酵解，而腫瘤細(xì)胞無(wú)論氧氣是否充足都主要依賴糖酵解進(jìn)行代謝供能，消耗大量葡萄糖并產(chǎn)生乳酸，此現(xiàn)象由德國(guó)生物學(xué)家Otto Warburg 所發(fā)現(xiàn)，故稱為Warburg效應(yīng)[11]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞優(yōu)先進(jìn)行糖酵解這一代謝現(xiàn)象，主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞選擇性地高表達(dá)糖酵解過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶---丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase type M2,PKM2)[12-13]。腫瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)PKM2獲得了優(yōu)先進(jìn)行糖酵解的代謝特性，使其即使在氧含量和營(yíng)養(yǎng)不足的環(huán)境下也得以生存，并獲取大量的能量用以維持自身的高度增殖和擴(kuò)散。因此，許多最近的研究著手解明PKM2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，并試圖通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞PKM2表達(dá)及代謝特性來(lái)找到腫瘤治療的新途徑[14]。近來(lái)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PKM2 在人肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較正常組織細(xì)胞明顯增加[15]，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默肺癌細(xì)胞中的PKM2 基因表達(dá)，導(dǎo)入同工酶PKM2，觀察糖代謝方面的變化，發(fā)現(xiàn)PKM2 表達(dá)是有氧糖酵解所必需的，這種代謝方式使腫瘤具有特異性的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平通過(guò)Lipofectamine 2000 和PKM2 siRNA形成的復(fù)合物成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CD44+肺癌干細(xì)胞。干擾PKM2 表達(dá)后，轉(zhuǎn)染CD44+肺癌干細(xì)胞中PKM2 表達(dá)量在mRNA水平和蛋白水平均顯著降低，證明了干擾效果的同時(shí)也證實(shí)了PKM2 在轉(zhuǎn)染CD44+肺癌干細(xì)胞中呈高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平通過(guò)Lipofectamine 2000 和PKM2 siRNA形成的復(fù)合物成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CD44+肺癌干細(xì)胞。干擾PKM2 表達(dá)后，CD44+肺癌干細(xì)胞中CD44在蛋白水平的表達(dá)也有不同程度的降低。PKM2 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)有多方面原因?，F(xiàn)已證實(shí)，其中一方面是由于PKM2 酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，使四聚體解離為二聚體，在腫瘤細(xì)胞中以磷酸化丙酮酸低親和力的二聚體形式優(yōu)先大量表達(dá)PKM2，二聚體的PKM2 與磷酸烯醇丙酮酸親和力低，從而導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積，使1,6-二磷酸果糖降解為丙酮酸明顯減少，而DNA合成增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[16]。

本研究證實(shí)了PKM2 在肺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞增殖，并且影響腫瘤干細(xì)胞的耐藥性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用，有可能成為治療肺癌和其他特異性表達(dá)PKM2 的惡性腫瘤的潛在新靶點(diǎn)。

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(編輯：吳小紅)

Effect of pkm2 Gene on Proliferation and Drug Resistance in CD44+

Lung Cancer Stem Cells

GUOChangying,KUANGYukang,LITaosheng.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of PKM2 and its effect on the proliferation and drug resistance in CD44+lung cancer stem cells.MethodsLung cancer A549 cells were separated into CD44+cells and CD44+cells by the immunomagnetic beads method through AutoMACS instrument,and then the PKM2 siRNA was transfected into CD44+lung cancer stem cells by Lipofectamine 2000.The experimental group and the control group were included in the study.qRT-PCR and western blot were used to measure the PKM2 expression at mRNA and protein levels,respectively.The cell proliferation was assessed by MTT assay.Drug sensitivity test:different chemotherapy drugs solubility of DDP were added into the culture medium,and then the cell proliferation was assessed by MTT assay.ResultsPKM2 siRNA was transfected into CD44+lung cancer stem cells,the expression of PKM2 mRNA and protein in CD44+cells decreased significantly (P<0.05),cell proliferation ability decreased,and anti-tumor drug resistance was reduced in CD44+cells.ConclusionPKM2 plays an important role in promoting the proliferation of CD44+lung cancer stem cells and enhancing the anti-tumor drug resistance.

【Key words】Lung cancer stem cells;PKM2;Proliferation;Drug resistance

(收稿日期2015-01-23修回日期 2015-03-16)

中圖分類號(hào)：R73-36

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)05-0641-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.05.004