徐偉華，趙 冬，戴 晶，劉 祺，許 暉，黃嘯元，王業(yè)忠

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·論著·

神經(jīng)元特異性烯醇化酶在神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型復(fù)氧后的表達(dá)變化

徐偉華，趙 冬，戴 晶，劉 祺，許 暉，黃嘯元，王業(yè)忠

目的 探討神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)在體外培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型復(fù)氧后的水平變化。方法 體外原代培養(yǎng)24 h內(nèi)的新生SD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光染色及電子顯微鏡鑒定神經(jīng)元，應(yīng)用體外氧糖剝奪建立大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元缺血低氧損傷模型，分別對復(fù)氧1、6、12、24、48、72 h神經(jīng)元提取蛋白質(zhì)，Western blotting法檢測不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元損傷模型中NSE表達(dá)水平。結(jié)果 培養(yǎng)第4天的細(xì)胞免疫熒光染色顯示神經(jīng)元細(xì)胞核染色清晰，形態(tài)典型，突起走形如網(wǎng)狀，陽性率為(93.6±1.6)%。各組NSE蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=500.75，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組損傷后各時(shí)間點(diǎn)NSE蛋白表達(dá)高于對照組，細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h NSE蛋白表達(dá)均高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。結(jié)論 NSE可作為自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)標(biāo)志物，能夠反映腦組織的損傷程度。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；原代細(xì)胞培養(yǎng)；海馬；神經(jīng)元；氧糖剝奪；神經(jīng)元特異性烯醇化酶

徐偉華，趙冬，戴晶，等.神經(jīng)元特異性烯醇化酶在神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型復(fù)氧后的表達(dá)變化[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(20)：2444-2447.[www.chinagp.net]

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自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(spontaneous subarachnoid hemorrhage，SAH)后早期腦損傷(early brain injury，EBI)是導(dǎo)致SAH患者死亡風(fēng)險(xiǎn)升高和不良預(yù)后的首要原因[1]，而海馬區(qū)神經(jīng)元是腦損傷最敏感的部位。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)在腦損傷診斷及患者預(yù)后評估中起重要作用[2]。本課題前期體外實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠SAH模型，于傷后1、6、12、24、48、72 h時(shí)采用酶標(biāo)免疫檢測法(ELTSA)檢測SD大鼠腦組織NSE水平，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)法檢測大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況，初步證實(shí)：NSE表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡數(shù)呈正相關(guān)。本研究通過體外培養(yǎng)神經(jīng)元，建立損傷模型，探討神經(jīng)元損傷與NSE表達(dá)水平變化，判斷不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元損傷的嚴(yán)重程度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取新生24 h內(nèi)SD大鼠3～4只，雌雄不限，SPF級，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要化學(xué)試劑 DMEM/F12(Hyclone公司)，Neurobasal A medium(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，B-27添加劑(Gibco公司)，左旋多聚賴氨酸(PLL，Sigma公司)，胰蛋白酶(Amerisco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone公司)，10 000 U/ml青霉素、10 000 U/ml鏈霉素和L-谷氨酰胺(Gibco公司)，NSE多克隆抗體(Gibco公司)，無血清培養(yǎng)基：Neurobasal培養(yǎng)基+2% B-27添加劑(50×)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆茫欢嗑?L-賴氨酸包被液：采用PBS配制1 mg/ml多聚-L-賴氨酸溶液，0.22 μm濾器過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分離及培養(yǎng) 取SD大鼠，常規(guī)碘伏消毒3遍后，75%乙醇消毒3遍，無菌條件下持眼科剪沿正中線剪開頭皮與顱骨，暴露兩側(cè)大腦半球，用眼科無齒鑷迅速取出整個(gè)腦組織，放入冰上盛有PBS的玻璃培養(yǎng)皿中，仔細(xì)剝離腦組織表面血管及腦膜，去除小腦、腦干，分離大腦皮質(zhì)，PBS清洗2～3遍(去除紅細(xì)胞)后，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，以0.25%胰蛋白酶在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中消化10～15 min(其間振蕩3次)，加入種植培養(yǎng)基(90% DMEM-F12+10% FBS)終止消化3～5 min，去除終止消化液，加入5 ml種植培養(yǎng)基(90% DMEM-F12+10% FBS)后將大腦皮質(zhì)吸至離心管A中，輕輕吹打10次(切記吹打時(shí)不可有氣泡產(chǎn)生)，冰中靜置2 min，吸取2 ml上清液至離心管B中，再次加入2 ml種植培養(yǎng)基(90% DMEM-F12+10% FBS)至離心管A中吹打10次，重復(fù)3遍，將裝有6 ml上清液的離心管B以1 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液后加入種植培養(yǎng)基，200目鋼篩過濾，輕輕吹打10次制成細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)拒染試驗(yàn)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)數(shù)，以1.0×105～1.0×106個(gè)/ml的密度接種于多聚-L-賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿中，置37 ℃ 5%CO295%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4～6 h后，將種植培養(yǎng)基全量換成飼養(yǎng)培養(yǎng)基(97% Neurobasal-A+2% B-27+1% L-谷氨酰胺)維持培養(yǎng)，每隔3 d飼養(yǎng)培養(yǎng)基全量換液。

1.4 免疫熒光[3]染色鑒定神經(jīng)元 神經(jīng)元培養(yǎng)第4天后首先用0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌5 min×3次。0.3% Triton X-100孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。5% BSA封閉1 h。孵育NSE多克隆抗體(1∶100，Gibco公司，USA)，4 ℃過夜。室溫復(fù)溫5 min，37 ℃恒溫30 min。孵育NSE二抗(1∶100，中杉金橋)，37 ℃ 1 h。0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。DAPI(1∶1 000，Sigma，USA)染細(xì)胞核5 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。50%甘油封片。培養(yǎng)板在普通熒光顯微鏡(Olympus，Japan)下檢測。對照實(shí)驗(yàn)只加0.01 mol/L PBS和二抗，細(xì)胞均為陰性染色?？贵w稀釋液為0.01 mol/L PBS。

1.5 神經(jīng)元損傷模型的建立 體外應(yīng)用氧糖剝奪模型，能夠較理想地模擬體內(nèi)缺血低氧情況。選取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元，倒去原培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍，加入無糖培養(yǎng)基，置于通入95% N2和5% CO237 ℃的恒溫低氧培養(yǎng)箱中，孵育60 min后，去除無糖培養(yǎng)基，重新加入飼養(yǎng)培養(yǎng)基(97% Neurobasal-A+2% B-27添加劑+1% L-谷氨酰胺)置于37 ℃ 5% CO295%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、6、12、24、48、72 h時(shí)提取神經(jīng)元蛋白質(zhì)。

1.6 Western blotting法檢測NSE蛋白表達(dá)水平 提取神經(jīng)元蛋白質(zhì)后，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠分離，采用半干法轉(zhuǎn)膜47 min，然后用5% BSA封閉2 h，加一抗置于搖床上放入4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，室溫下?lián)u床上孵育二抗2 h，化學(xué)發(fā)光，曝光，于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下，初次分離種植的海馬神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，胞體透明，體積小，無突起，單個(gè)散在分布。培養(yǎng)4～6h，大部分細(xì)胞基本貼壁，12h可見部分細(xì)胞伸出短小突起，胞體立體感強(qiáng)，發(fā)亮。培養(yǎng)1d，突起的長度增加(見圖1A)；培養(yǎng)3d，細(xì)胞明顯增多，胞體明顯增大，飽滿，突起明顯增長，多呈雙極、多極突起，相互連接交織成網(wǎng)狀(見圖1B)；培養(yǎng)5～7d，胞體聚集，突起縱橫交錯(cuò)，增粗、增長，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(見圖1C、D)。

注：圖A、B分別為培養(yǎng)1、3d細(xì)胞形態(tài)；圖C、D為培養(yǎng)5～7d細(xì)胞形態(tài)

圖1 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)變化(×200)

Figure1Morphologicalchangesofrathippocampusneuroncellsatdifferenttimepointsduringinvitroculture

2.2 免疫熒光染色鑒定觀察結(jié)果 選取培養(yǎng)第4天的細(xì)胞(此時(shí)細(xì)胞形態(tài)較為典型，且膠質(zhì)細(xì)胞尚未發(fā)育成熟)，免疫熒光染色，以胞質(zhì)和/或突起染成黃綠色為陽性，整個(gè)細(xì)胞都不被染色為陰性。在20倍物鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野范圍內(nèi)的所有細(xì)胞，分別統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核數(shù)(細(xì)胞總數(shù))，計(jì)算陽性率(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞核數(shù))，陽性率的平均數(shù)代表神經(jīng)元的純度[4]。經(jīng)鑒定，神經(jīng)元細(xì)胞核染色清晰，形態(tài)典型，突起走形如網(wǎng)狀，陽性率為(93.6±1.6)%，見圖2。

注：A為細(xì)胞核藍(lán)染，代表細(xì)胞總數(shù)；B為陽性神經(jīng)元；C為陰性神經(jīng)元

圖2 免疫熒光染色計(jì)數(shù)陽性神經(jīng)元

Figure 2 Neuron cells of positive immunofluorescence staining

2.3 Western blotting檢測NSE蛋白表達(dá) 各組NSE蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=500.75，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組損傷后各時(shí)間點(diǎn)NSE蛋白表達(dá)高于對照組，細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h NSE蛋白表達(dá)均高于細(xì)胞培養(yǎng)其他時(shí)間點(diǎn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3、4)。

注：NSE=神經(jīng)元特異性烯醇化酶

圖3 Western blotting檢測不同時(shí)間點(diǎn)NSE蛋白表達(dá)水平

Figure 3 NSE protein expression levels tested by Western blotting at different time points

注：與對照組比較，aP<0.05

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)NSE蛋白表達(dá)水平比較

Figure 4 Comparison of NSE protein expression level at different time points

3 討論

EBI是指SAH發(fā)生后72 h內(nèi)出現(xiàn)的全腦直接損傷[5]，早期海馬區(qū)神經(jīng)元即可出現(xiàn)凋亡、壞死及數(shù)目減少，在SAH患者預(yù)后中起重要作用。因此，EBI的研究在SAH患者的治療、預(yù)防中具有很大的潛力，能有效減輕SAH造成的損傷，對降低SAH后致殘率和病死率有重要意義[6]。

近年來，許多臨床及實(shí)驗(yàn)研究顯示，NSE僅存在于神經(jīng)元及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞質(zhì)中，正常情況下，血清和腦脊液中NSE的含量極少，然而在腦損傷后，部分神經(jīng)元壞死、崩解，從而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞膜破壞，NSE可釋放入細(xì)胞間隙和腦脊液中，通過血-腦脊液屏障(BBB)進(jìn)入血液和腦脊液中。因此，NSE在腦損傷中的變化水平目前已成為廣大學(xué)者的研究熱點(diǎn)。有報(bào)道認(rèn)為，腦脊液或血液中增高的NSE與神經(jīng)元損傷的數(shù)目有關(guān)[7]。本研究通過Western blotting檢測神經(jīng)元損傷模型中NSE蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，在神經(jīng)元損傷后1 h即有NSE低表達(dá)，而在6 h時(shí)NSE表達(dá)明顯增加，且逐漸增多，24～48 h達(dá)到高峰，72 h表達(dá)逐漸減少，提示建模1 h后神經(jīng)元即有損傷并逐漸加重，24～48 h最嚴(yán)重，與本課題前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)神經(jīng)元損傷后可引起NSE升高，血液中NSE升高及升高的幅度可以反映腦損傷的程度及范圍[8-9]。

有報(bào)道認(rèn)為，腦出血后血腫周圍神經(jīng)元的死亡形式主要以凋亡為主[10-11]。有研究表明，SAH發(fā)生后的整個(gè)EBI過程中，同側(cè)額葉基底皮質(zhì)的自體吞噬顯著增加，造成了神經(jīng)元的損傷，并引起一系列的功能障礙[12]。在SAH發(fā)生后，凋亡級聯(lián)反應(yīng)很早就被激活，引起腦水腫、腦血管痙攣、全腦缺血、免疫炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等導(dǎo)致廣泛性的細(xì)胞凋亡[13]，主要包括BBB、海馬和血管內(nèi)皮細(xì)胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育階段中神經(jīng)元凋亡最早出現(xiàn)，成年個(gè)體極少見神經(jīng)元凋亡，一般多發(fā)生在病理情況下[14]。探索細(xì)胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮的作用，對揭示神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生機(jī)制及病程的進(jìn)展有重要意義[15]。本課題前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后6 h即出現(xiàn)大量TUENL染色陽性細(xì)胞，24～48 h達(dá)到高峰后逐漸下降[16]，這與本實(shí)驗(yàn)中NSE表達(dá)的時(shí)間趨于一致，提示在腦損傷發(fā)生發(fā)展過程中，海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡發(fā)揮了重要的作用，NSE水平升高在一定程度上能夠反映腦損傷的嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能與神經(jīng)元的凋亡率增高有關(guān)。

綜上所述，NSE作為一種簡便易行的生化監(jiān)測指標(biāo)，能夠直接反映腦損傷的程度及范圍，監(jiān)測其水平變化在早期腦損傷患者病情判斷及臨床診療過程中存在一定的參考價(jià)值。此外，細(xì)胞凋亡對SAH后早期腦損傷的發(fā)生、發(fā)展有著重要作用，抑制海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡是否能夠改善SAH后早期腦損傷患者的預(yù)后仍需進(jìn)一步研究探討。

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(本文編輯：賈萌萌)

Changes of the Expression of Neuron Specific Enolase After the Reoxygenation of Neuron Model Damaged by Oxygen-glucose Deprivation

XUWei-hua，ZHAODong，DAIJing，etal.

MedicalSchoolofShiheziUniversity，Shihezi832000，China

Objective To explore the changes of the expression of neuron specific enolase(NSE)after the reoxygenation of in vitro culture neuron model damaged by oxygen-glucose deprivation.Methods In vitro primary culture was conducted on the neurons in hippocampus area of newborn SD rats within 24 hours.Evaluation of the neurons was carried out by using immunofluorescent staining and electron microscope.By oxygen-glucose deprivation，the damaged neuron model which was ischemic and hypoxic was established.Protein was extracted from the model 1，6，12，24，48 and 72 hours after reoxygenation，and Western blotting method was used to test NSE expression level in the model at different time points.Results On day 4 during in vitro culture，immunofluorescent staining showed clear nuclear staining，typical shape of net with protuberance and deformation and a positive rate of(93.6±1.6)%.The two groups were significantly different in NSE protein expression level(F=500.75，P<0.01).The trial group was higher(P<0.05)than the control group in NSE protein expression at different time points after neuron damage.The NSE protein expression levels at hour 24 and hour 48 during in vitro culture were higher(P<0.05)than those at other time points.Conclusion NSE could be used as an indicator of SAH and EBI，for it could reflect the damage degree of brain tissue.

Subarachnoid hemorrhage；Primary cell culture；Hippocampus；Neurons；Oxygen-glucose deprivation；Neuron specific enolase

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360185)；新疆生產(chǎn)兵團(tuán)博士基金資助項(xiàng)目(2011BB016)

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院(徐偉華，黃嘯元)；石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(趙冬，戴晶，劉祺，許暉，王業(yè)忠)

王業(yè)忠，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；E-mail：wangyz2008@126.com

R 743.35

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.20.020

2015-01-03；

2015-04-20)