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        中分子量羥乙基淀粉對脊髓壓迫傷后神經(jīng)痛的作用

        2015-03-01 01:55:16劉宏波宋振全梁國標王志軍趙明光
        創(chuàng)傷外科雜志 2015年2期
        關(guān)鍵詞:中樞性分子量膠質(zhì)

        劉宏波,宋振全,梁國標,王志軍,趙明光,趙 旭,雷 偉,李 賓

        脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是交通、工礦事故及運動意外中的常見損傷,是一種嚴重危害人類健康的疾病。資料顯示,世界上脊髓損傷患者超300 萬[1],SCI后神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)的發(fā)生率很高(40% ~50%)[2]。其中,中樞性疼痛(central pain,CP)為SCI的頑固性并發(fā)癥[3],近年來其發(fā)病率有逐年增高的趨勢,但其發(fā)病機制目前尚不清楚,臨床治療效果并不令人滿意。目前認為既有外周神經(jīng)敏化又有中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化,除受損神經(jīng)敏化,未受損神經(jīng)以及膠質(zhì)細胞也參與發(fā)病過程[4],尤以神經(jīng)膠質(zhì)細胞(星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞)及神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的相互作用在SCI后的CP中扮演重要角色,其作用主要通過分泌多種細胞因子得以實現(xiàn)[5-6]。另外,神經(jīng)病理性疼痛一般均伴有血管功能異常及炎癥現(xiàn)象[7],而就脊髓損傷而言,血管結(jié)構(gòu)和神經(jīng)成分的破壞導致復雜劇烈的炎癥反應,神經(jīng)膠質(zhì)細胞連同外周血白細胞在其中起到重要的作用[8-9]。脊髓損傷后的神經(jīng)膠質(zhì)細胞將炎癥反應與CP的發(fā)生聯(lián)系在一起。血脊髓屏障(blood spinal cord barrier,BSCB)是血腦屏障的一部分,功能在于維持脊髓內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定;脊髓損傷后,不僅破壞脊髓的實質(zhì),同時破壞了血管的結(jié)構(gòu),損傷內(nèi)皮細胞,BSCB也不可避免地遭到破壞,對受損脊髓炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展有著重要的作用[10]。

        羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch,HES)是一種血容量擴張劑,有維持血液膠體滲透壓的作用,從上世紀60年代起,作為容量替代和血液稀釋的血漿代用品開始在臨床上大量使用[11-12]。除了其膠體擴容作用,中等分子量HES(100~1000 kD)還可以改善血管內(nèi)皮細胞的功能,防止和堵塞毛細血管漏,減輕BSCB開放;全分子量HES(10~3400 kD)無該作用,低分子量HES的作用尚無相關(guān)報道[13-17]。

        本實驗研究大鼠SCI模型建立后通過給予HES(中分子量和小分子量),探討其對中樞性疼痛的作用。

        材料與方法

        1 實驗動物及分組

        SD雄性成年大鼠48只,由錦州醫(yī)學院實驗動物中心提供,體重200~230g。隨機分入脊髓壓迫損傷組(A組),脊髓損傷聯(lián)合低分子量HES治療組(B組),脊髓損傷聯(lián)合中分子量HES治療組(C組),以及假手術(shù)組(D組),每組12只。假手術(shù)組僅行椎板去除術(shù),A組、B組和C組在脊髓損傷模型建立后經(jīng)尾靜脈按15ml/kg給予生理鹽水、低分子量HES(HES 40,706代血漿,平均分子量40)、中分子量HES(HES 130/0.4,萬汶,德國費森尤斯卡比股份有限公司,平均分子量130kD,取代級0.4),5% ×動物血容量/次,2次/d。各組在模型建立后3d測BSCB破壞情況(n=5),10d進行行為學觀察、形態(tài)學觀察和分子生物學檢測。本實驗符合錦州醫(yī)學院動物實驗倫理委員會要求。

        2 脊髓壓迫傷模型[18]

        所有器械經(jīng)高壓蒸汽滅菌。大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g)后,取俯臥位,于顯微鏡下,將大鼠T7、T8雙側(cè)椎弓根切斷,隨后取下椎板,緊接著植入一種吸水膨脹材料(醫(yī)用PU泡棉),隨著壓迫物的膨脹逐漸形成不同程度的慢性壓迫脊髓損傷實驗動物模型。術(shù)后逐層縫合肌肉和皮膚后回籠飼養(yǎng),定時定量給以軟飼料喂養(yǎng),飲水不加限制。術(shù)后開始每日腹腔注射青霉素8萬U/只,慶大霉素0.2萬U/只,預防術(shù)后感染,維持7d。術(shù)后大鼠每日行膀胱按摩人工排尿2次,直到動物恢復排尿反射。

        3 疼痛行為學測定

        機械性痛覺過敏:以不同粗細和不同長度的尼龍絲制成14個刺激強度不同(1.0~60g)的機械刺激器(von-Frey纖維)。將一20cm×20cm×25cm的透明有機玻璃罩放置于金屬絲制成的網(wǎng)格墊上,將待測大鼠置于罩中。使其適應30min后試驗者手持von-Frey纖維穿過金屬絲網(wǎng)格分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心部位,刺激強度由小到大,每個強度反復刺激5次(每次間隔3~5s),將出現(xiàn)50%以上縮足反射的強度定為大鼠對機械性痛敏壓力閾值(paw withdrawal pressure threshold,PWPT)。如以60g von-Frey纖維刺激大鼠足底仍不出現(xiàn)縮足反射,則認為大鼠無痛反應;機械刺激閾值<0.1g均以0.1g計:這種刺激的原理是當尼龍纖維受阻彎曲后其尖端壓力不變,故可以認為每個測量值都是恒定的。

        熱痛覺過敏:將大鼠置于20cm×20cm×25cm的透明有機玻璃罩中,底部為距試驗臺30cm的2mm厚的玻璃板。應用RTY 3型熱刺激儀(西安鳳嵐儀器廠)。選擇100W鹵素投射燈,調(diào)節(jié)電壓至10V,調(diào)節(jié)燈源與玻璃板之間的距離,使落在足底的照射光圈直徑為5mm,記錄從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時間(s),作為熱痛敏反應潛伏期(paw withdrawal latency,PWL);重復測量3~5次,同一部位間隔10min,不同部位間隔5min,取平均值為熱痛敏反應潛伏期并作為定量指標。如>40s無反應則停止照射,以免導致足底組織過度熱損傷。

        4 脊髓組織伊文氏藍(EB)含量的測定

        傷后3d的大鼠,經(jīng)大鼠固定器后經(jīng)尾靜脈注射2%EB(2ml/kg體重),20min后迅速斷頭取脊髓(以損傷節(jié)段為中心約2.5cm長),剝除硬脊膜并洗去血凝塊,稱重并置于等體積甲酰胺中,置37℃水浴48h,在波長632nm處測光密度值(OD)。

        5 組織學觀察

        動物于相應時間以10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g)后,灌注固定后取出損傷區(qū)吻端2.5cm到馬尾的脊髓并置于含25%蔗糖的4%多聚甲醛溶液中,至標本沉底。每例脊髓取兩段:Ⅰ,第一段損傷區(qū)為中心的1.6cm節(jié)段,Ⅱ,第二段L3~S4節(jié)段,冰凍切片機(德國,Leica公司)以10μm厚連續(xù)切片。

        切片行免疫熒光雙重標記:一抗:兔源抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多抗(1:500,Sigma),兔源抗小膠質(zhì)細胞(Iba1)單抗(1∶400,Sigma),小鼠源抗單核巨噬細胞抗原1(ED1)單抗(1:400,Sigma)。二抗:偶聯(lián)異硫氰酸熒光素(FITC)山羊源抗兔二抗(1:500,Sigma),偶聯(lián)德克薩斯紅(TRITC)的兔源抗小鼠二抗(1:400,Sigma)。著色完畢封片后,在激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000系統(tǒng),奧林巴斯公司)上觀察并采圖。

        6 脊髓組織蛋白提取和定量

        各組大鼠分別在相應時間隨機取4只,腹腔麻醉、斷頭取以損傷區(qū)為中心的1.6cm節(jié)段和L3~S4節(jié)段,裝入5ml滅菌離心管并立即置于液氮中保存?zhèn)溆?。組織塊稱量、切碎,置于含0.5%Triton X-100的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 7.0,20mmol/L)內(nèi),4℃浸泡24h,組織濃度標準化至400mg/ml。浸泡后,12 000r/min(4℃)離心 20min,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度后,調(diào)至相同濃度,收集上清液并分裝,-80℃冰箱保存。

        Western blotting檢測分析星形膠質(zhì)細胞(GFAP)、小膠質(zhì)細胞(Iba1)、活化小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞(ED1):每孔樣本上樣量為350μg/L,所用分離膠的濃度為120ml/L。將樣本加入凝膠樣本孔中,以70V的條件進行SDS-PAGE凝膠電泳;結(jié)束后,以110V的條件轉(zhuǎn)膜3h;用100g/L脫脂奶粉封閉1h后與抗AIP抗體(1:400稀釋)4℃反應過夜;經(jīng)洗滌后再與二抗反應3h,最后用western blot蛋白質(zhì)印跡法(ECL)化學發(fā)光底物檢測膜上的抗原抗體復合物。

        酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測IL-1、IL-6、TNF-α,試劑盒購自美國Abcam公司。具體操作步驟按試劑盒說明書的操作方法進行。

        7 統(tǒng)計學分析

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析,本課題研究結(jié)果均以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        1 HES對血脊髓屏障的影響

        根據(jù)前期實驗結(jié)果,脊髓壓迫損傷后BSCB便遭到破壞,傷后3d即達最大值,7d基本恢復正常。本實驗選擇在傷后3d對各組間BSCB破壞程度進行比較:A組脊髓實質(zhì)內(nèi)EB含量明顯高于假手術(shù)組(D組),B組與A組間無統(tǒng)計學差異,C組EB含量顯著低于A組和B組,差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。

        2 HES 對慢性中樞性疼痛的作用

        脊髓壓迫損傷后可造成后肢癱瘓,傷后8~12d達到足底著地程度,運動功能逐漸恢復,此時才能得到穩(wěn)定的疼痛閾值。本實驗對術(shù)前1d和術(shù)后10、14、20、30、60d 各組大鼠的 PWPT 和 PWL 進行測量。術(shù)前各組間PWPT和PWL無顯著性差異。A組術(shù)后10d始,PWPT和PWL均顯著降低,且隨后各時間點較10d無明顯差異;B組術(shù)后各時間點較A組未見明顯差異;C組術(shù)后所測時間點的PWPT和PWL均較A組和B組明顯升高(圖2)。

        圖1 傷后3d,脊髓組織內(nèi)EB含量

        圖2 機械痛敏和熱痛敏比較

        3 HES對炎癥反應的影響

        據(jù)報道,脊髓壓迫損傷后,活化小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞反應在傷后7d達到高峰,本實驗選擇在傷后7d比較各組炎癥反應程度。

        對損傷段脊髓組織GFAP表達量進行觀察,組間均未見差異;Iba1和ED1分別為巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白和溶酶體膜蛋白標記物,可反映巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞活化程度。傷后10d,損傷段:D組各時間點均可表達一定量Iba1和少量ED1,A組兩者的表達較D組有明顯上調(diào),B組較A組無明顯變化,同時刻C組較A組和B組均明顯下降(圖3、4)。

        對傷后7d脊髓炎性細胞因子表達IL-1、IL-6、TNF-α進行觀察:損傷段A組與B組間未見明顯差異,D組高于A組和B組,而C組較A組和B組均明顯下降(圖5)。

        圖3 損傷段脊髓傷后7d,活化小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞觀察

        圖4 損傷段脊髓傷后7d,星形膠質(zhì)細胞(GFAP)、活化小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞(Iba1,ED1)特異性標記物表達

        圖5 損傷段脊髓傷后7d,IL-1、IL-6、TNF-α細胞因子表達

        討 論

        中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,神經(jīng)軸突難以再生,導致神經(jīng)功能無法正?;謴停颊咴趽p傷平面以下存在感覺、運動、反射及尿便功能障礙[19-20]。而中樞性疼痛為脊髓損傷的頑固性并發(fā)癥。其致病機制尚不明確,至今仍無有效的治療手段。目前有文獻報道膠質(zhì)細胞的活化以及一些細胞因子和趨化因子(IL-1等)與脊髓損傷后中樞性疼痛密切相關(guān)[21]。在脊髓損傷后,組織發(fā)生水腫、缺血低氧,并且血漿內(nèi)的各種分子無選擇性地進入脊髓實質(zhì)內(nèi)部,進而誘發(fā)一系列繼發(fā)性損傷并加重脊髓的損傷。BSCB的破壞范圍也隨之擴大,其結(jié)構(gòu)功能的異常導致血液成分、外周炎性成分大量進入脊髓實質(zhì),脊髓內(nèi)的膠質(zhì)細胞被激活[21-25],從而外周單核巨噬細胞和活化的小膠質(zhì)細胞參與到脊髓損害后炎癥反應[26-27]。

        中分子量的HES可通過多種機制抑制毛細血管漏,挽救異常通透的BSCB,而其他分子量HES無此作用[28-29]。本實驗結(jié)果顯示SCI動物脊髓損傷區(qū)BSCB通透異常增高,傷后2~3d達到最大值,給予HES 130/0.4可以使之顯著緩解,HES 40組(對照組)未見相應效果。而SCI后行為學觀察后肢PWPT和PWL明顯降低,HES 130/0.4組痛閾顯著回升,HES 40組則對痛閾沒有影響。上述實驗結(jié)果都表明HES 130/0.4可以緩解SCI后CP的程度,而其機制很可能為挽救異常通透的BSCB。HES 130/0.4在脊髓損傷區(qū)節(jié)段可降低巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞活化程度,并使損傷區(qū)的趨化因子表達下調(diào)??梢哉f明IL-1、IL-6、TNF-α 表達下調(diào)可能為 HES 130/0.4 緩解CP的機制之一;而這些細胞因子在受損脊髓主要由活化的巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞所分泌,所以給予HES 130/0.4后巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞活化水平的下調(diào)可以進一步支持上述推測。HES 40組未見HES 130/0.4的上述作用,可以說明低分子量HES對脊髓損傷后BSCB破壞沒有緩解作用,亦間接地說明擴容作用不是HES 130/0.4改善脊髓損傷后并發(fā)炎癥和CP的機制。

        綜上所述,本實驗結(jié)果說明HES 130/0.4對脊髓損傷后并發(fā)的中樞性疼痛有緩解作用,其機制可能為通過改善異常通透的BSCB來抑制其損傷區(qū)域的炎癥反應。目前,通過干預脊髓損傷后炎癥反應來影響中樞性疼痛的研究國內(nèi)外少有報道;通過調(diào)節(jié)BSCB功能來干預脊髓損傷中樞性神經(jīng)病理性疼痛的研究尚處于初級階段,相應的機制研究亦較少,很多還停留在脊髓損傷后BCSB與繼發(fā)性損傷的相關(guān)研究中。通過少量研究報道,我們發(fā)現(xiàn)炎癥反應在脊髓損傷后并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。對該機制的研究,可能優(yōu)化我們現(xiàn)有治療的方法,為脊髓損傷后的診治提供一個新的思路。

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