彭小勇，李 濤，劉良明，朱 娛，藍(lán) 丹，吳 躍，楊光明

缺血缺氧是多種疾病均存在的一種病理狀態(tài)，是引起重要組織器官損傷最常見的因素。創(chuàng)傷失血性休克是導(dǎo)致機(jī)體有效循環(huán)血量不足、組織器官缺血缺氧的主要原因。防止休克后缺血缺氧所致器官損傷的關(guān)鍵是恢復(fù)有效血流灌注、改善組織氧供［1］。因此，尋找有效的改善組織缺血缺氧狀態(tài)和器官功能的抗休克措施具有重要意義。4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，PBA)是一種具有多種功能的新藥，在臨床上主要用于治療兒童腎臟疾病和鐮狀細(xì)胞貧血等疾?。?－3］，近來它在缺血缺氧和再灌注損傷中的作用成為臨床醫(yī)生和研究者關(guān)注的焦點(diǎn)［3－4］。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，PBA對(duì)創(chuàng)傷性休克大鼠有明顯的治療作用，能顯著改善休克動(dòng)物的存活情況，那么它是否通過改善重要器官的血流灌注和線粒體功能對(duì)器官功能發(fā)揮作用?本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠128只(由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄各半，體重180～220g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為4組:乳酸林格氏液(LR)組、PBA 5mg/kg組、PBA 20mg/kg組、PBA 50mg/kg組，每組分別在休克前、休克末、復(fù)蘇后1h和2h檢測各項(xiàng)指標(biāo)，每組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)8只大鼠。本實(shí)驗(yàn)常規(guī)方法制備創(chuàng)傷失血性休克模型［5］:用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，右側(cè)股動(dòng)脈插管供觀察血壓和放血，股靜脈插管用于給藥復(fù)蘇，折斷大鼠左側(cè)股骨，同時(shí)通過股動(dòng)脈插管放血至血壓40mmHg，維持3h。休克模型成功后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行復(fù)蘇，LR組輸注2倍失血量的LR，PBA組按照分組劑量將PBA加入LR中輸注，休克對(duì)照組不予復(fù)蘇。

2.2 肝、腎血流量及肝、腎功能檢測 在各時(shí)相點(diǎn)，行剖腹手術(shù)，充分暴露大鼠的肝臟和腎臟，用激光多普勒血流儀(PF5001，Perimed，瑞典)的探針刺入肝、腎組織下0.5cm左右，測定肝、腎并記錄血流量。然后抽取2ml動(dòng)脈血用生化分析儀(BXC800，Beckman，美國)檢測肝、腎功能指標(biāo)，包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)和血肌酐(CREA)。

2.3 肝、腎、腸線粒體功能測定 取大鼠肝、腎和小腸組織，在冰上提取線粒體，用溶氧儀(MT200，Strathkelvin，蘇格蘭)測定線粒體功能。在30℃恒溫條件下校準(zhǔn)儀器，將提取的線粒體懸液加入反應(yīng)介質(zhì)中，觀察在有二磷酸腺苷(ADP)刺激下的耗氧量(3態(tài)呼吸)和無ADP刺激下的耗氧量(4態(tài)呼吸)，線粒體功能以其比值(呼吸控制率，RCR)來反映［6］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎血流量的影響

休克后大鼠的肝、腎血流量均顯著下降(P＜0.01)。LR輸注使肝、腎血流量有輕度升高。20mg/kg的PBA輸注可明顯恢復(fù)肝血流量，顯著高于LR組(P＜0.01)，而PBA 5和50mg/kg組與LR組無明顯差異;各劑量PBA都可明顯升高腎臟血流量，均高于LR組(P＜0.01)，其中PBA 20mg/kg的恢復(fù)作用最為顯著(圖1)。

圖1 PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝(A)、腎(B)血流量的影響

2 PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎功能的影響

休克明顯引起了肝、腎功能的損傷，反映肝、腎功能的各項(xiàng)指標(biāo)，包括AST、ALT、BUN和CREA在休克后均顯著高于正常水平(P＜0.01)。PBA 20mg/kg輸注可降低休克大鼠血漿中ALT和CREA的水平，明顯低于LR組(P＜0.05～0.01)。但LR和PBA輸注對(duì)休克后升高的AST和BUN無明顯影響(表1)。

3 PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎和小腸線粒體功能的影響

休克后大鼠的肝、腎、腸線粒體功能均顯著下降。LR復(fù)蘇對(duì)各器官線粒體功能的改善作用不明顯。PBA 5和20mg/kg可明顯恢復(fù)肝線粒體功能，3個(gè)劑量的PBA都能明顯升高腎和腸的線粒體功能，其作用顯著高于 LR組(P＜0.01)。其中 PBA 20mg/kg的效果最為明顯，PBA 20mg/kg組大鼠肝、腎、腸線粒體呼吸功能分別恢復(fù)至正常水平的88.7%、98.7%和101.0%(表2)。

表1 PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎功能的影響

表2 PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝、腎、腸線粒體功能的影響

討 論

PBA是一種具有多種功能的新型藥物，除了臨床上用于治療尿素循環(huán)障礙和貧血等疾病外，研究顯示PBA在多種疾病過程中能發(fā)揮改善器官功能的作用，包括阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓及多種缺血缺氧性疾?。?－4，7］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PBA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克有很好的治療作用，但它是通過什么途徑發(fā)揮抗休克作用?本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，休克引起了重要生命器官如肝和腎的血流量降低，同時(shí)反映肝、腎功能的四項(xiàng)重要指標(biāo)均顯著升高;PBA(20mg/kg)輸注可恢復(fù)休克后降低的肝、腎血流量，并降低肝、腎功能的指標(biāo)ALT和CREA，提示PBA對(duì)肝、腎等重要器官的血流灌注和功能都有較好的改善作用。線粒體是為細(xì)胞提供能量的重要細(xì)胞器，因此成為休克后缺血缺氧損傷的直接靶點(diǎn)，而線粒體功能紊亂直接影響細(xì)胞的功能和生存，最終導(dǎo)致組織器官損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，休克后大鼠肝、腎、腸的線粒體功能都顯著下降，PBA可明顯改善各器官的線粒體功能，其中20mg/kg的PBA的作用最為顯著，使治療后大鼠的線粒體功能接近正常水平。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PBA 50 mg/kg對(duì)血流量和線粒體功能等指標(biāo)的改善作用低于PBA 20mg/kg，并且 PBA 50mg/kg輸注后肝功能指標(biāo)ALT和AST并未降低、反而接近或高于休克組水平，提示高劑量的PBA可能增加發(fā)生不良反應(yīng)的危險(xiǎn)。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)僅初步觀察到此現(xiàn)象，其可能原因需要更多的實(shí)驗(yàn)來研究。

目前研究顯示，PBA主要通過2條途徑來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。一是作為化學(xué)分子伴侶，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的作用;二是具有組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACi)的功能［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、參與蛋白質(zhì)合成、加工和運(yùn)輸?shù)闹匾?xì)胞器，在細(xì)胞代謝、功能發(fā)揮和細(xì)胞生存中具有重要作用。在多種病理狀態(tài)下，刺激因素可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。大量文獻(xiàn)已證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的共同的關(guān)鍵因素，PBA作為分子伴侶可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕ERS引起的器官損傷［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間存在復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能上的聯(lián)系，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和釋放鈣入胞漿中，引起線粒體的膜電位降低和線粒體功能障礙，進(jìn)一步增加了活性氧的產(chǎn)生，而活性氧可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣，使線粒體內(nèi)鈣積聚，形成惡性循環(huán)，加重細(xì)胞損傷。此外，PBA作為HDACi可參與染色質(zhì)組蛋白乙酰化的調(diào)節(jié)、發(fā)揮對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，故以往主要關(guān)注它的抗腫瘤作用，但近來研究發(fā)現(xiàn)HDACi對(duì)多種非腫瘤疾病也有治療作用，如PBA通過其HDAC抑制功能發(fā)揮在亨丁頓病和脊髓性肌肉萎縮癥中的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［3，9］。

綜上所述，輸注PBA能夠明顯增加肝、腎等重要器官的血流量、促進(jìn)線粒體功能恢復(fù)、改善重要器官功能，對(duì)休克后缺血缺氧損傷有明顯的治療作用。但缺血缺氧損傷可激活多條級(jí)聯(lián)反應(yīng)，PBA是如何發(fā)揮改善器官和線粒體功能的作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

［1］劉良明.戰(zhàn)創(chuàng)傷休克早期救治研究進(jìn)展［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2013，15(2):100 －103.

［2］Lee B，Rhead W，Diaz GA，et al.Phase 2 comparison of a novel ammonia scavenging agent with sodium phenylbutyrate in patients with urea cycle disorders:safety，pharmacokinetics and ammonia control［J］.Mol Genet Metab，2010，100(3):221 －228.

［3］Mimori S，Ohtaka H，Koshikawa Y，et al.4 － Phenylbutyric acid protects against neuronal cell death by primarily acting as a chemical chaperone rather than histone deacetylase inhibitor［J］.Bioorg Med Chem Lett，2013，23(21):6015 －6018.

［4］Fessler EB，Chibane FL，Wang Z，et al.Potential roles of HDAC inhibitors in mitigating ischemia－induced brain damage and facilitating endogenous regeneration and recovery［J］.Curr Pharm Des，2013，19(28):5105 －5120.

［5］楊光明，李濤，徐競，等.V1a/V2受體在精氨酸血管加壓素恢復(fù)失血誘導(dǎo)大鼠血管低反應(yīng)性中的作用［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2008，10(1):47 －50.

［6］Li T，Lin X，Zhu Y，et al.Short－ term，mild hypothermia can increase the beneficial effect of permissive hypotension on uncontrolled hemorrhagic shock in rats［J］.Anesthesiology，2012，116(6):1288 －1298.

［7］Cuadrado － Tejedor M，Ricobaraza AL，Torrijo R，et al.Phenylbutyrate is a multifaceted drug that exerts neuroprotective effects and reverses the Alzheimer＇s disease － like phenotype of a commonly used mouse model［J］.Curr Pharm Des，2013，19(28):5076 －5084.

［8］Mandl J，Mészáros T，Bánhegyi G，et al.Minireview:endoplasmic reticulum stress:control in protein，lipid，and signal homeostasis［J］.Mol Endocrinol，2013，27(3):384 －393.

［9］Wiech NL，F(xiàn)isher JF，Helquist P，et al.Inhibition of histone deacetylases:a pharmacological approach to the treatment of non － cancer disorders［J］.Curr Top Med Chem，2009，9(3):257－271.