凍前預(yù)處理對(duì)薩?？巳庋蚓豪鋬鲂Ч挠绊?/h1>
2015-03-01 09:01:54茍想珍王珂何茂昌楊薦俊劉彥軍
中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘 2015年8期
茍想珍王 珂何茂昌楊薦俊劉彥軍
(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000；2.定西旺盛養(yǎng)殖有限公司,甘肅定西 743000；3.定西市團(tuán)結(jié)鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,甘肅定西 743000)
凍前預(yù)處理對(duì)薩?？巳庋蚓豪鋬鲂Ч挠绊?/p>
茍想珍1王 珂1何茂昌1楊薦俊2劉彥軍3
(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000；2.定西旺盛養(yǎng)殖有限公司,甘肅定西 743000；3.定西市團(tuán)結(jié)鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,甘肅定西 743000)
通過(guò)對(duì)薩?？巳庋蛐迈r精液在離心前進(jìn)行不同時(shí)間的靜置，選擇不同的離心速度及離心時(shí)間進(jìn)行冷凍前預(yù)處理，以解凍后精子活率，復(fù)蘇率為判斷指標(biāo)，比較了各種不同預(yù)處理對(duì)薩?？司豪鋬鲂Ч挠绊憽＝Y(jié)果表明:離心前在37℃環(huán)境下靜置60min的凍后效果（活率達(dá) 0.47和復(fù)蘇率達(dá)到73.8%）優(yōu)于 30min 和 90min 的凍后效果（p＜0.05）；離心過(guò)程以 1000r/min 的速度離心 10min 較好，凍后活率 0.45，復(fù)蘇率達(dá)到74.5%，優(yōu)于500r/min 和 1500r/min轉(zhuǎn)速和其他時(shí)間（p＜0.05）。
薩?？巳庋?冷凍精液 預(yù)處理 冷凍效果
精液的冷凍保存技術(shù)是隨著人工授精（AT）的發(fā)展而發(fā)展起來(lái)的，是通過(guò)降低或抑制精子新陳代謝強(qiáng)度從而達(dá)到延長(zhǎng)精子在體外生存的目的。以精液體外保存為基礎(chǔ)的人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用已經(jīng)加速了動(dòng)物的遺傳選擇并使生產(chǎn)能力得到極大的提高。
薩福克肉羊號(hào)稱世界上長(zhǎng)得最快的肉用型品種，早熟，生長(zhǎng)快，產(chǎn)肉多，肉質(zhì)好，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖率達(dá)到160%-210%。為了有效地解決肉用種羊缺乏的現(xiàn)狀，節(jié)省優(yōu)質(zhì)種羊引種費(fèi)用和飼養(yǎng)管理成本，開(kāi)發(fā)薩?？巳庋蚋叨似焚|(zhì)冷凍精液，擴(kuò)大良種覆蓋率，建立良種繁育體系，良種雜交改良體系，質(zhì)量監(jiān)督體系，開(kāi)展集約化，精準(zhǔn)化，產(chǎn)業(yè)化，綠色化的發(fā)展模式。
1 材料與方法
1.1 樣品來(lái)源
精液樣品采集于甘肅定西旺盛養(yǎng)殖有限公司選擇成年，體質(zhì)健康，性欲旺盛，配種頻率正常的薩福克肉羊，收集中段富含精子部分，經(jīng) 4 層滅菌紗布過(guò)濾，用保溫瓶在 37℃左右運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，生物顯微鏡下進(jìn)行精液品質(zhì)常規(guī)檢查，選擇活率 0.7 以上，密度“中”級(jí)以上的精液用于實(shí)驗(yàn)。
1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，800 型電動(dòng)離心機(jī)，400-600X 生物顯微鏡，電子天平，超低溫溫度計(jì)，氟板，5L 液氮罐，烘箱，高溫高壓滅菌器，普通冰箱及羊用采精器械和冷凍器械等。
1.3 精液的預(yù)處理
1.3.1 離心前靜置時(shí)間
將采集的合格精液保存在 37℃左右的保溫瓶中，分別靜置30min、60min 和 90min。
1.3.2 離心
分別以 500r/min、1000r/min、1500r/min 的速度離心 7min、10min 和 15min。
1.4 冷凍精液制作與解凍
用液氮熏蒸法制作細(xì)管凍精，劑量為 0.5ml，解凍時(shí)用40～45℃溫水。
1.5 數(shù)據(jù)處理
應(yīng)用 t 檢驗(yàn)和方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 離心前靜置時(shí)間對(duì)薩福克肉羊凍精活率及復(fù)蘇率的影響
本研究在稀釋前采用 30 min、60 min 和 90 min 3 種不同的靜置時(shí)間對(duì)精液凍后活率的影響見(jiàn)表1。精液離體后靜置 60 min 再采取 1 000 r/min 的速度離心，凍后活率及復(fù)蘇率明顯優(yōu)于靜置30 min和90 min（p＜0.05），凍后精子活率達(dá) 0.47，復(fù)蘇率達(dá)73.8%。
2.2 離心速度及離心時(shí)間對(duì)凍后活率及復(fù)蘇率的影響
對(duì)薩?？诵迈r精液采用 500 r/min、1 000 r/min 和 1 500 r/min的速度分別離心 7 min、10 min和 15 min，分別制成細(xì)管凍精和顆粒凍精，同時(shí)，在相同條件下解凍（45℃溫水）。結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)采用500 r/min 的速度離心時(shí)，離心時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)凍后精子活率及復(fù)蘇率的影響都非常明顯。而采用 1 000 r/min 的速度離心，精子活率最高可達(dá) 0.45，復(fù)蘇率也能達(dá)到 74.5%，這表明，離心時(shí)間對(duì)精液的凍后活率影響較大，通常以離心 10 min 較好，在細(xì)管凍精中表現(xiàn)非常明顯（P＜0.05）。離心速度以1 000 r/min 較為理想。
表1 離心前靜置時(shí)間對(duì)凍后活率及復(fù)蘇率的影響
表2 離心速度及離心時(shí)間對(duì)凍后活率及復(fù)蘇率的影響
3 討論
（1）本研究在稀釋前將精液分別靜置 30min，60min 和90min，結(jié)果表明，平衡 60min可有效地使精子和精清接觸，以增強(qiáng)精子對(duì)冷休克及冷凍損傷的抵抗能力，靜置時(shí)間太長(zhǎng)可引起精漿變質(zhì)而對(duì)精子產(chǎn)生影響，同時(shí)，精子不運(yùn)動(dòng)也容易形成假死狀態(tài)，該結(jié)果與 Paulenz所采用的豬精液 Beltsville 預(yù)處理方法所獲得的結(jié)果相同。
（2）本研究采用不同的離心速度和離心時(shí)間，結(jié)果表明，以1000r/min 的離心速度離心10min 較好，解凍后活率達(dá)到 0.45。這主要是由于不離心，精液體積過(guò)大稀釋效果不佳，而過(guò)快的離心速度則使精子在離心管底部凝結(jié)，導(dǎo)致形態(tài)異常，活率降低。也有報(bào)道表明，薩?？司簝銮耙?1200r/min 的速度離心 10 分鐘較好，本研究認(rèn)為，在平?jīng)龅貐^(qū)以 1000r/min 的速度離心較好。
4 結(jié)論
（1）精液稀釋前的靜置時(shí)間，以在37℃下靜置60min較好，優(yōu)于30min和90min（p＜0.05）。
（2）離心時(shí)以 1000r/min 的速度離心 10min 較好，優(yōu)于其他的速度時(shí)間。
[1] Pursel V G，Johnson L A. Freezing of boar spermatozoa：fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure[J]. Journal of Animal Science，1975，40：99—102
[2] Paulenz H，Taugbol O. Effect of dietary supplementation with cold liver oil on cold shock and freezability of boar semen. Reprod-domestanim. Berlin：Blackwell Wissenschafts-Verlag GmbH[J]. Oct 1999. v. 34（5）：431-435.
[3] 淵錫藩，邢小軍，吳繼東，等.冷凍精液的溫度控制[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2005，3（13）：3-5.
[4] 楊俊濤.牛精液冷凍稀釋液的改進(jìn)研究[D].中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)2007.
[5] 蘇永生，呂軍峰，張力.薩?？巳庋蛞N效果及推廣建議[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2005，6：54-57.
[6] 唐道廉.薩?？巳庋螂s交效果的試驗(yàn)研究[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（6-7）：17-18.
[7] 李穎康，達(dá)文政，吳艷華，等.肉羊?qū)Ｓ闷贩N-薩福克肉羊的類型和生產(chǎn)性能[J].中國(guó)草食動(dòng)物，2003，（1）：48.
[8] 淵錫藩，張玲，邢小軍.影響精液質(zhì)量的幾個(gè)冷凍技術(shù)因素[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).1995（3）.
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將采集的合格精液保存在 37℃左右的保溫瓶中，分別靜置30min、60min 和 90min。
1.3.2 離心
分別以 500r/min、1000r/min、1500r/min 的速度離心 7min、10min 和 15min。
1.4 冷凍精液制作與解凍
用液氮熏蒸法制作細(xì)管凍精，劑量為 0.5ml，解凍時(shí)用40～45℃溫水。
1.5 數(shù)據(jù)處理
應(yīng)用 t 檢驗(yàn)和方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 離心前靜置時(shí)間對(duì)薩福克肉羊凍精活率及復(fù)蘇率的影響
本研究在稀釋前采用 30 min、60 min 和 90 min 3 種不同的靜置時(shí)間對(duì)精液凍后活率的影響見(jiàn)表1。精液離體后靜置 60 min 再采取 1 000 r/min 的速度離心，凍后活率及復(fù)蘇率明顯優(yōu)于靜置30 min和90 min（p＜0.05），凍后精子活率達(dá) 0.47，復(fù)蘇率達(dá)73.8%。
2.2 離心速度及離心時(shí)間對(duì)凍后活率及復(fù)蘇率的影響
對(duì)薩?？诵迈r精液采用 500 r/min、1 000 r/min 和 1 500 r/min的速度分別離心 7 min、10 min和 15 min，分別制成細(xì)管凍精和顆粒凍精，同時(shí)，在相同條件下解凍（45℃溫水）。結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)采用500 r/min 的速度離心時(shí)，離心時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)凍后精子活率及復(fù)蘇率的影響都非常明顯。而采用 1 000 r/min 的速度離心，精子活率最高可達(dá) 0.45，復(fù)蘇率也能達(dá)到 74.5%，這表明，離心時(shí)間對(duì)精液的凍后活率影響較大，通常以離心 10 min 較好，在細(xì)管凍精中表現(xiàn)非常明顯（P＜0.05）。離心速度以1 000 r/min 較為理想。
表1 離心前靜置時(shí)間對(duì)凍后活率及復(fù)蘇率的影響
表2 離心速度及離心時(shí)間對(duì)凍后活率及復(fù)蘇率的影響
3 討論
（1）本研究在稀釋前將精液分別靜置 30min，60min 和90min，結(jié)果表明，平衡 60min可有效地使精子和精清接觸，以增強(qiáng)精子對(duì)冷休克及冷凍損傷的抵抗能力，靜置時(shí)間太長(zhǎng)可引起精漿變質(zhì)而對(duì)精子產(chǎn)生影響，同時(shí)，精子不運(yùn)動(dòng)也容易形成假死狀態(tài)，該結(jié)果與 Paulenz所采用的豬精液 Beltsville 預(yù)處理方法所獲得的結(jié)果相同。
（2）本研究采用不同的離心速度和離心時(shí)間，結(jié)果表明，以1000r/min 的離心速度離心10min 較好，解凍后活率達(dá)到 0.45。這主要是由于不離心，精液體積過(guò)大稀釋效果不佳，而過(guò)快的離心速度則使精子在離心管底部凝結(jié)，導(dǎo)致形態(tài)異常，活率降低。也有報(bào)道表明，薩?？司簝銮耙?1200r/min 的速度離心 10 分鐘較好，本研究認(rèn)為，在平?jīng)龅貐^(qū)以 1000r/min 的速度離心較好。
4 結(jié)論
（1）精液稀釋前的靜置時(shí)間，以在37℃下靜置60min較好，優(yōu)于30min和90min（p＜0.05）。
（2）離心時(shí)以 1000r/min 的速度離心 10min 較好，優(yōu)于其他的速度時(shí)間。
[1] Pursel V G，Johnson L A. Freezing of boar spermatozoa：fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure[J]. Journal of Animal Science，1975，40：99—102
[2] Paulenz H，Taugbol O. Effect of dietary supplementation with cold liver oil on cold shock and freezability of boar semen. Reprod-domestanim. Berlin：Blackwell Wissenschafts-Verlag GmbH[J]. Oct 1999. v. 34（5）：431-435.
[3] 淵錫藩，邢小軍，吳繼東，等.冷凍精液的溫度控制[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2005，3（13）：3-5.
[4] 楊俊濤.牛精液冷凍稀釋液的改進(jìn)研究[D].中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)2007.
[5] 蘇永生，呂軍峰，張力.薩?？巳庋蛞N效果及推廣建議[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2005，6：54-57.
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