張德利， 馬 艷， 李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科， 河北 承德 067000)

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過程，涉及到多方面機(jī)制。研究表明轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGFβ)/Smads信號(hào)通路中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的紊亂，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究通過檢測正常胃組織和胃癌中TGFβ1、Smad7基因以及蛋白的表達(dá)，分析它們與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象:收集我院2011年12月至2012年9月手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)的胃癌組織標(biāo)本60例，同時(shí)收集正常胃組織20例(切緣距離腫瘤邊緣10cm以上認(rèn)為正常胃組織)。60例胃癌患者中，男性38例，女性22例;年齡43－77歲，平均年齡54.8±9.7歲;其中低分化者32例，高中分化者28例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。

1.2 RT－PCR所用試劑:AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(BK1040)(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);50bp DNA Ladder(北京天根生化有限公司MD108);肌動(dòng)蛋白(β－actin)上游引物序列:5'－CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC －3'，下游引物序列:5＇－CTCCTTAATGTCACGCACGAT－3'。TGF 1上游引物序列:5'－GGCCAGATCCTGTCCAAGC－3'，下游引物序列:5'－GTGGGTTTCCACCATTAGCAC－3'。Smad7上游引物序列:5’－TTCCTCCGCTGAAACAGGG－3’，下游引物序列:5’－CCTCCCAGTATGCCACCAC －3’。

1.3 方 法

1.3.1 提取RNA及RNA定量:①充分預(yù)冷研缽，把組織從液氮罐中取出放入研缽中仔細(xì)研磨，控制每例標(biāo)本質(zhì)量100mg左右，研磨成粉末狀后，加Trizol試劑1mL，將其擊成碎塊，至1.5mLEP管中，混勻室溫靜置5min，4℃，離心12000rpm10min，將上清移入新EP管。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄:反轉(zhuǎn)錄過程:1μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:25℃，10min;37℃，50min;70℃，15min;4℃，5min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)

1.3.3.1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系，見表 2。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.3.3.2 循環(huán)設(shè)置:①TGF 1擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán);94℃ 變性 30s，55℃ 退火 30s，72℃ 延伸30s，共35個(gè)循環(huán);72℃總延伸6min。②Smad7擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán);94℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸 30s，共 30個(gè)循環(huán);72℃總延伸6min。③瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析:取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物及6μL的DNA Ladder進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(120V，45min)，紫外熒光數(shù)字成像儀下照像，采用Image pro plus 7.0軟件統(tǒng)計(jì)各條帶的積分光密度值，以積分光密度值比值分析各組間差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

在胃癌組織中，TGFβ1，Smad7 mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，低分化胃癌組織中TGFβ1和Smad7 mRNA水平明顯高于高中分化胃癌組織(P＜0.05)。TGFβ1，Smad7 mRNA的表達(dá)與胃癌的分化程度有關(guān)(圖1)。見表3。

圖1 TGFβ1、Smad7 mRNA在各組織中的表達(dá)(±s，n=6)M:100 bp DNA Marker;1:正常胃癌組織;2:高中分化胃癌組織;3:低分化胃癌組織

表3 TGFβ1 mRNA、smad7 mRNA水平的表達(dá)在不同臨床病理特征中的關(guān)系

3 討論

TGFβ是重要的細(xì)胞因子之一，對(duì)細(xì)胞分裂和增殖具有抑制作用。研究結(jié)果顯示，惡性細(xì)胞對(duì)TGFβ產(chǎn)生抵抗作用與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，TGFβ信號(hào)通路一旦改變，對(duì)靶細(xì)胞失去有效抑制作用，甚至可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［1］。Smad蛋白家族指的是TGFβ信號(hào)傳遞通路中的中轉(zhuǎn)分子，從胞質(zhì)進(jìn)入胞核［2］。Smad7在基礎(chǔ)狀態(tài)下大部分位于細(xì)胞核中，Smad7是TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)途徑中必需的下游分子，與多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。Smad7異常表達(dá)，拮抗了TGFβ通路，從而使其不能有效監(jiān)督腫瘤細(xì)胞過度增生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［3］。

TGFβ1調(diào)控的基因通常依賴于TGFβ1活化的下游分子R－smad(受體－smad)中的一個(gè)，即Smad2或Smad3，Smad3磷酸化和核轉(zhuǎn)位主要發(fā)生在活化的細(xì)胞，Smad2激活主要發(fā)生在靜止和中間細(xì)胞［4］。在炎癥性腸病(IBD)病人腸道內(nèi)Smad3磷酸化水平下降，伴有Smad7顯著增高。研究結(jié)果表明，Smad7可通過抑制Smad3的活化磷酸化、影響Smad3/Smad4異源復(fù)合物的形成及核轉(zhuǎn)位，最終拮抗TGFβ對(duì)細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中 TGFβ1與Smad7的表達(dá)是互相調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮作用的。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β作用較長時(shí)間(2d)后，可直接導(dǎo)致興奮性信號(hào)分子Smad3的基因表達(dá)水平下降，抑制性信號(hào)分子Smad7的基因表達(dá)水平顯著上升，而使胞內(nèi)TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能下調(diào)，細(xì)胞對(duì)TGF－β的反應(yīng)減弱。Smad3功能受高表達(dá)Smad7抑制，不能有效啟動(dòng)介導(dǎo)生長終止基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞生長發(fā)生紊亂，從而有可能向惡性化發(fā)展［5，6］。此外，在體外正常皮膚成纖維細(xì)胞中，TGF－β可使Smad7的表達(dá)快速而短暫地被誘導(dǎo)，這就提示Smad7是TGF－β早期即刻基因作用的靶點(diǎn)，作用是自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)。說明TGF－β刺激Smads信號(hào)通路功能的活化，同時(shí)對(duì)內(nèi)源性Smads的表達(dá)也起到了潛在的調(diào)節(jié)作用［7］。

有研究報(bào)道TGFβ1在前列腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中呈過度表達(dá)，其過度表達(dá)在腫瘤轉(zhuǎn)化、進(jìn)展中起重要作用并與預(yù)后相關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織TGFβ1呈過表達(dá)狀態(tài)，隨著胃癌臨床病理分期的進(jìn)展，TGFβ1表達(dá)逐漸加強(qiáng)，提示我們TGFβ1有可能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。這與Naef等［9］的研究結(jié)果一致，另外TGFβ1在腫瘤中高表達(dá)的原因還可能由于胃癌組織細(xì)胞失去了對(duì)TGFβ1的敏感性，導(dǎo)致TGFβ1的反饋性表達(dá)升高。近來的報(bào)道顯示，Smad7基因擴(kuò)增與胃癌，結(jié)腸癌患者的預(yù)后不良有著密切的關(guān)系。表明TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子Smad7過表達(dá)是腫瘤細(xì)胞抵抗TGF－β的生長抑制作用的機(jī)制之一。最近的研究還顯示，Smad7可以不依賴于TGF－β而獨(dú)立發(fā)揮其生物學(xué)功能，并與腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。

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