龔震宇，馮小艷，熊銳華，詹 球，李小龍

封閉式負(fù)壓引流技術(shù)(vacuum-assisted closure，VAC)是近年來興起的一種促進(jìn)創(chuàng)面愈合的新型治療方法，是通過將吸引裝置與傷口敷料連接后，使創(chuàng)面維持在負(fù)壓狀態(tài)下，起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。它是由Fleischmann首創(chuàng)的可控制全創(chuàng)面高負(fù)壓持續(xù)引流演變而來，目前被廣泛運(yùn)用到各種急慢性創(chuàng)面的治療與促進(jìn)創(chuàng)面愈合中［1］。放射性皮膚潰瘍(radiation ulcer)是常見的皮膚損害，臨床上主要是由腫瘤的放射性治療、意外放射照射事故引起。隨著腫瘤放射治療的廣泛開展，臨床上放射性潰瘍發(fā)生率逐年增加。一旦潰瘍形成，若不及時(shí)處理會造成潰瘍加深、出血、感染等危害，甚至危及患者的生命。放射性潰瘍的治療正越來越受到臨床醫(yī)生關(guān)注［2］。筆者采用兔放射性潰瘍模型，觀察了VAC對兔放射性潰瘍創(chuàng)面組織愈合的影響，旨在為探討VAC促進(jìn)難愈性創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇16只清潔級新西蘭白兔作為研究對象，由解放軍第一八一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，飼養(yǎng)時(shí)控制溫度在(22.6±2.3)℃，濕度在(60.5±5.0)%。按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，其中，對照組8只，雌3只，雄5只，平均體質(zhì)量(2.2±0.2)kg;實(shí)驗(yàn)組8只，雌4只，雄4只，平均體質(zhì)量(2.3±0.3)kg。2組白兔均在相同環(huán)境下用相同份量的飼料飼養(yǎng)。

1.2 設(shè)備及試劑 武漢維斯第醫(yī)用科技股份有限公司提供的封閉負(fù)壓引流治療系統(tǒng)，通過電腦控制的壓力裝置產(chǎn)生持續(xù)負(fù)壓;北京醫(yī)研所生產(chǎn)的BJ-6B直線加速器;Promega公司生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒擴(kuò)增MMP-1、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2;成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)試劑盒購自晶美生物工程(北京)有限公司。

1.3 兔放射性潰瘍模型制作及處理 每只兔均單籠喂養(yǎng)，后臀部剃毛，未使用硫化鈉脫毛。24 h后確認(rèn)脫毛區(qū)無損傷后接受照射。照射前采用3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，劑量30 mg/kg。照射范圍為兔后臀部約直徑5cm圓形皮膚。1次照射劑量為35 Gy，造成深Ⅱ度創(chuàng)面模型。照射條件:BJ-6B直線加速器(北京醫(yī)研所)，6 MV高能X射線，源皮距100cm，準(zhǔn)直器:直徑5cm。劑量率300 cGy/min。皮膚外加蓋1.3cm有機(jī)玻璃片，以使照射最大吸收劑量位于皮膚處。照射后各組兔均正常單籠喂養(yǎng)。照射后14 d創(chuàng)面出現(xiàn)后，按照分組，分別采用VAC治療及常規(guī)包扎，直至創(chuàng)面取材或創(chuàng)面愈合。

1.4 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 創(chuàng)面肉眼觀察及愈合時(shí)間 肉眼觀察創(chuàng)面腫脹及分泌物情況，觀察創(chuàng)面壞死組織清除及肉芽組織的生長情況;記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間，愈合時(shí)間即創(chuàng)面完全上皮化所需的時(shí)間。

1.4.2 創(chuàng)面組織基質(zhì)金屬蛋白酶與金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的測定 在實(shí)驗(yàn)前、損傷后第3、第7和第14天均取潰瘍中央肉芽組織進(jìn)行處理。MMP-1、MMP-2和 TIMP-1反應(yīng)條件均為60℃下1 min，68℃下2 min和68℃下7 min，TIMP-2 反應(yīng)條件為52℃下1 min，68℃下2 min和68℃下7 min，每項(xiàng)檢查均行30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物均于1.2%瓊脂糖上觀察電泳情況，經(jīng)掃描系統(tǒng)測定密度值。

1.4.3 血清生長因子含量測定 在實(shí)驗(yàn)前、損傷后第3、第7和第14天采用ELISA法檢測白兔血清bFGF和VEGF的含量，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒的要求進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 2組創(chuàng)面肉眼觀察及愈合時(shí)間比較 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面采用VAC處理后，肉眼觀察可見創(chuàng)面腫脹及分泌物與對照組比較明顯得到控制，創(chuàng)面壞死組織的清除與肉芽組織的生長也比對照組也明顯加快;實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為(16.3±2.6)d，對照組創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為(20.4±3.7)d，組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.357，P＜0.05)。

2.2 2組創(chuàng)面組織基質(zhì)金屬蛋白酶與金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)前2組創(chuàng)面MMP-1和MMP-2 mRNA的表達(dá)比較，分別t=0.824和t=0.737，均P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而損傷后第3、第7和第14天創(chuàng)面 MMP-1和 MMP-2 mRNA的表達(dá)比較，均P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組均顯著低于對照組(表1);實(shí)驗(yàn)前2組創(chuàng)面TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達(dá)比較，分別t=0.688和t=0.596，均P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而損傷后第3、第7和第14天創(chuàng)面TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達(dá)比較，均P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對照組(表2)。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組創(chuàng)面組織基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)比較(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組創(chuàng)面組織基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)比較(±s)

注:與對照組比較aP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)MMP-2實(shí)驗(yàn)前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天 實(shí)驗(yàn)前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天MMP-1對照組 8 83.4±12.3 66.3±10.2 54.7±9.2 36.5±7.5 79.4±10.9 62.7±9.8 49.6±8.9 34.2±6.8實(shí)驗(yàn)組 8 84.6±12.9 51.6±9.5a 42.8±8.6a 29.7±6.4a 80.3±11.6 50.4±9.1a 39.7±8.2a 25.3±6.1a

2.3 2組血清細(xì)胞因子表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)前2組血清bFGF和VEGF的表達(dá)比較，分別t=0.406和t=0.669，均P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而損傷后第3、第7和第14天血清bFGF和VEGF的表達(dá)比較，均P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對照組(表3)。

3 討論

目前，皮膚放射性損傷臨床上主要由X線、γ射線及β射線一次大劑量或反復(fù)多次照射引起。損傷的程度因射線的劑量、種類不同而有差別，X線、γ射線均可引起電離輻射，而電離輻射能夠?qū)⒛芰總鬟f給如蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)與活性的改變，也可通過產(chǎn)生的自由基損傷生物分子［3］。皮膚表皮細(xì)胞及附屬器對各種射線均較為敏感，受到射線照射后會出現(xiàn)一系列的變化，引起皮膚破潰，并逐漸發(fā)展為放射性潰瘍。放射性潰瘍在顯微鏡下顯示具有較少的肉芽組織以及成纖維細(xì)胞，增生細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少并發(fā)生破裂、擴(kuò)張;線粒體可出現(xiàn)腫脹空化，微管微絲減少，各種細(xì)胞器明顯減少;周圍組織內(nèi)浸潤的漿細(xì)胞發(fā)生變性，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞因增生而導(dǎo)致血管腔狹窄;潰瘍底部及周圍纖維組織因膠原變性而出現(xiàn)玻璃樣變性，同時(shí)放射性潰瘍周圍成纖維細(xì)胞的數(shù)量及合成能量均下降。這些都導(dǎo)致了皮膚放射性潰瘍傷口收縮不良以及愈合延遲［4-5］。

VAC通過封閉的類似吸盤裝置以及相關(guān)管道做負(fù)壓吸引治療，負(fù)壓直接作用于潰瘍創(chuàng)面，增加了創(chuàng)面局部血流量，激活了創(chuàng)面細(xì)胞的活性。同時(shí)持續(xù)的負(fù)壓吸引作用于創(chuàng)面，還可及時(shí)吸出創(chuàng)面的滲液，防止因創(chuàng)面滲液積聚形成細(xì)菌培養(yǎng)基，且持續(xù)的負(fù)壓吸引增加了創(chuàng)傷處細(xì)胞的張力，起到了機(jī)械性牽引的作用，利于創(chuàng)面的愈合［6-7］。目前研究認(rèn)為，VAC通過以下機(jī)制促進(jìn)創(chuàng)面愈合［8-12］:(1)促進(jìn)創(chuàng)面局部微循環(huán)和肉芽組織生長。創(chuàng)面長期不能愈合多是由于創(chuàng)面局部血供不佳，導(dǎo)致創(chuàng)面組織氧代謝不足。在缺氧的環(huán)境下，創(chuàng)面局部組織會出現(xiàn)代謝紊亂，抑制了局部組織細(xì)胞的增殖。VAC由于去除了局部組織過多的液體，緩解了局部水腫，對周圍組織小血管的壓迫得以解除;同時(shí)負(fù)壓下細(xì)小動(dòng)脈會擴(kuò)張，增加了細(xì)胞的有絲分裂，加強(qiáng)了創(chuàng)面周圍微血管的增生，有效降低了血管后負(fù)荷，潰瘍局部血流得以恢復(fù)，這又促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合;VAC還可促進(jìn)肉芽組織形成。肉芽組織的形成可為上皮組織生長提供條件，利于創(chuàng)面愈合;(2)減輕局部組織水腫。局限性水腫既起到壓迫創(chuàng)面局部血管與淋巴系統(tǒng)，增加創(chuàng)面的皮膚張力的作用;還能夠起到加重創(chuàng)面局部微血管后負(fù)荷，減少皮瓣血液供應(yīng)增加的作用，這些均對創(chuàng)面的愈合產(chǎn)生不良影響。VAC的負(fù)壓系統(tǒng)可有效去除創(chuàng)面滲出物與壞死組織，能夠有效減少周圍組織間壓力和組織間液體的積聚，因而降低了周圍血管的通透性，緩解了組織水腫;(3)促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞增殖及抑制凋亡。VAC可在創(chuàng)面形成一種機(jī)械應(yīng)力，這種力在降低創(chuàng)面張力的同時(shí)也可通過細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，最終將信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核。這促進(jìn)了生長因子的合成與分泌，如PG、蛋白激酶C、磷酸肌醇和Ca2+等，這些生長因子通過作用誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等組織細(xì)胞增生、蛋白產(chǎn)物合成及血管生成，促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合;(4)抑制細(xì)菌繁殖，清除壞死物質(zhì)。潰瘍創(chuàng)面延遲愈合甚至不愈合往往與創(chuàng)面感染相關(guān)，同時(shí)細(xì)菌競爭性消耗了局部組織修復(fù)所需要的氧氣與營養(yǎng)，局部大量細(xì)菌繁殖也改變了創(chuàng)面微環(huán)境，這對正常組織細(xì)胞的生長起到了抑制作用，最終造成創(chuàng)面的不易愈合。VAC可令創(chuàng)面保持封閉狀態(tài)，對外來細(xì)菌及有害微生物有效隔離，避免了細(xì)菌的交叉感染;封閉所營造的低氧環(huán)境也對細(xì)胞增殖起到抑制作用，引流也促進(jìn)了創(chuàng)面細(xì)菌、壞死物及滲出物的清除，破壞了利于細(xì)菌生長的環(huán)境，顯著降低了創(chuàng)面細(xì)菌感染率。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組創(chuàng)面組織金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的表達(dá)比較(±s)

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組創(chuàng)面組織金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的表達(dá)比較(±s)

注:與對照組比較aP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)TIMP-2實(shí)驗(yàn)前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天 實(shí)驗(yàn)前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天TIMP-1對照組 8 26.3±6.4 35.2±7.1 54.5±7.8 76.5±8.7 31.6±7.6 44.3±8.1 60.2±8.8 83.6±9.8實(shí)驗(yàn)組 8 25.7±6.1 46.3±7.7a 63.6±8.3a 84.3±9.5a 30.3±7.3 56.2±8.8a 75.4±9.3a 96.4±10.7a

表3 實(shí)驗(yàn)組與對照組血清細(xì)胞因子表達(dá)比較(ng/L，±s)

表3 實(shí)驗(yàn)組與對照組血清細(xì)胞因子表達(dá)比較(ng/L，±s)

注:與對照組比較aP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)實(shí)驗(yàn)前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天 實(shí)驗(yàn)前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天對照組 8 0.64±0.21 1.06±0.35 1.48±0.69 1.92±0.84 1.32±0.64 1.47±0.64 1.64±0.92 2.03±1.04實(shí)驗(yàn)組 8 0.67±0.23 1.33±0.42a 2.07±0.81a 2.65±1.02a 1.35±0.68 1.83±0.82a 2.23±1.08a 2.96±1.12a

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是調(diào)節(jié)膠原代謝的主要酶類，MMPs是一類活性依賴于金屬鋅離子的蛋白酶，是降解I、II、III型膠原的關(guān)鍵酶，對創(chuàng)面的膠原降解起著重要作用，MMPs的活性主要受到TIMPs的抑制，TIMPs能夠減少膠原的過度降解，TIMPs不足可導(dǎo)致創(chuàng)面不愈合。MMPs與TIMPs在創(chuàng)面的愈合過程中均起到了十分重要的作用［13］。bFGF能夠直接作用于成纖維細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體，促進(jìn)這類細(xì)胞發(fā)生分裂增殖，bFGF能夠促進(jìn)毛細(xì)血管的增生，改善創(chuàng)面局部的微循環(huán)與營養(yǎng)狀況，增加肉芽組織的沉積，促使其由創(chuàng)緣向中心的爬行，起到加速創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程的作用。VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的促血管生成細(xì)胞生長因子，能夠選擇性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，促進(jìn)EC的遷移與增殖，加快創(chuàng)面局部新生血管的形成，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合［14-15］。筆者通過臨床觀察證實(shí)，與未采用VAC相比，創(chuàng)面腫脹及分泌物得到明顯控制，創(chuàng)面壞死組織的清除與肉芽組織的生長明顯加快;平均愈合時(shí)間明顯縮短(P＜0.05);同時(shí)損傷后3d、7d和14d創(chuàng)面組織MMP-1和MMP-2 mRNA的表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達(dá)明顯增加(P＜0.05);血清bFGF和VEGF的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，這均說明了VAC對兔放射性潰瘍創(chuàng)面組織的愈合起到積極的促進(jìn)作用。

［1］李勇.封閉式負(fù)壓吸引技術(shù)在糖尿病潰瘍中的應(yīng)用［J］.中國社區(qū)醫(yī)師，2012，22(14):67-68.

［2］李順堂，劉達(dá)恩.慢性放射性皮膚潰瘍形成及難愈機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2012，34(4):474-477.

［3］Goessler UR，Bugert P，Kassner S，et al.In vitro analysis of radiation-induced dermal wounds［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2010，142(6):845-850.

［4］王學(xué)鋒，崔向琴，劉懷英.三種藥物外敷治療放療所致皮膚損傷的療效觀察［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2011，19(7):1172.

［5］牛東星.慢性放射性潰瘍19例治療總結(jié)［J］.中國廠礦醫(yī)學(xué)，2009，22(5):581-582.

［6］Petkar KS，Dhanraj P，Kingsly PM，et al.A prospective randomized controlled trial comparing negative pressure dressing and conventional dressing methods on split-thickness skin grafts in burned patients［J］.Burns，2011，37(6):921-925.

［7］Stannard JP，Volgas DA，Mc Gwin，et al.Incisional negative pressure wound therapy after high-risk lower extremity fractures［J］.J Orthop Trauma，2012，26(1):37-42.

［8］Borgquist O，Ingemansson R，Malmsjo M.Wound edge microvascular blood flow during negative-pressure wound therapy:examining the effects of pressures from-10 to-175 mmHg［J］.Plast Reconstruct Surg，2010，125(2):502-509.

［9］Hutchison RL，Craw JR.Use of acellular dermal regeneration template combined with NPWT to treat comp licated extremity wounds in children［J］.J Wound Care，2013，22(12):708-712.

［10］Peer SM.Negative pressure wound therapy for sternal wound infections following congenital heart surgery［J］.J Wound Care，2014，23(1):31-36.

［11］焦嬌，王鵬華，褚月頡，等.封閉負(fù)壓引流促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合機(jī)制的研究［J］.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2014，34(1):10-14.

［12］Irkoren S，Sivrioglu N，Karaca H.Rare complication after VAC therapy in the treatment of tissue defect due to surgical excision of pilonidal sinus［J］.J Wound Ostomy Contin Nurs，2013，40(6):641-643.

［13］盛巡，李光善，李萍，等.瘍愈涂劑對糖尿病大鼠創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ膠原合成及MMPs、TIMP-1表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2005，21(8):1508-1513.

［14］隋繼強(qiáng)，郭樹忠，吳紅，等.血管內(nèi)皮因子、人表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子納米緩釋劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的比較［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2008，17(4):534-537.

［15］Bharara M，Najafi B，Armstrong DG.Methodology for use of a neuroprosthetic to reduce plantar press ure:applications in patients with diabetic foot disease［J］.J Diabet Sci Technol，2012，6(1):222-224.