宮碧霜,任 曼,靳二輝,李倩倩,李秀榮,李升和

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

異亮氨酸對大鼠血清抗氧化水平及脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

宮碧霜,任 曼,靳二輝,李倩倩,李秀榮,李升和*

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

目的:研究飲水添加不同濃度異亮氨酸對SD大鼠血清抗氧化能力及脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響。方法:清潔級斷奶健康SD大鼠48只，雌雄各24只，隨機分為對照組和試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組雌雄各6只，雌雄大鼠分籠飼養(yǎng)；各組飲水中分別添加0、0.5、2.5、5 mg/mL異亮氨酸，試驗期28天。試驗結(jié)束后，大鼠乙醚麻醉，按試驗要求取材，檢測血清總谷胱甘肽(T-GSH)和丙二醛(MDA)活性，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，顯微觀察并攝影。結(jié)果:與對照組比較，試驗Ⅰ組雌鼠和試驗III組雄鼠血清T-GSH活性顯著升高(P<0.05)，試驗Ⅰ組雌鼠和試驗II組雄鼠血清MDA含量顯著降低(P<0.05)。顯微觀察可見，試驗Ⅰ組雌鼠和試驗II組雄鼠脾臟脾小結(jié)增多、增大，動脈周圍淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞排列較密集。結(jié)論:飲水添加0.5%異亮氨酸可提高雌鼠血清抗氧化能力，改善其脾臟組織結(jié)構(gòu)；添加2.5%異亮氨酸則對雄鼠血清抗氧化水平及脾臟組織結(jié)構(gòu)的作用更為明顯。

異亮氨酸；血清抗氧化能力；脾臟；組織結(jié)構(gòu)

異亮氨酸(isoleucine, ILE)，又稱異白氨酸，為機體必需氨基酸，屬支鏈氨基酸(branched-chain amino acid, BCAA)，其味苦，溶于水，微溶于乙醇。研究表明，支鏈氨基酸具有氧化供能、促進蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)降解、促進糖的異生、增強免疫力、調(diào)節(jié)母畜泌乳和調(diào)節(jié)激素分泌等功能[1]。異亮氨酸作為一種重要必需氨基酸，除影響蛋白沉積，還參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種代謝和功能。黃紅英[2]等研究發(fā)現(xiàn)，添加纈氨酸和異亮氨酸，可明顯提高初乳的總必需氨基酸、總非必需氨基酸及總氨基酸的含量，提高哺乳母豬的日采食量和改善母豬乳品質(zhì)，進而提高哺乳仔豬生長性能。路凱[3]等以增重率(weight gain rate,WGR) 和蛋白質(zhì)沉積率(protein deposit rate,PR)為評價指標(biāo)，得出生長中期花鱸對飼料中L-異亮氨酸的需求量分別為1.88%和1.84%飼料干重，占飼料蛋白質(zhì)的4.41%和4.32%。有研究表明，葫蘆巴活性成分4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine, 4-HIL)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞，呈現(xiàn)典型的脂肪細(xì)胞表型，誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中有90%的細(xì)胞中富含有較大的脂滴[4]。目前，有關(guān)異亮氨酸在人和動物營養(yǎng)方面的研究越來越多，但有關(guān)異亮氨酸對大鼠血清抗氧化水平及脾臟組織結(jié)構(gòu)影響的報道還較為少見。為此，本研究以SD大鼠為試驗動物，研究飲水添加不同水平異亮氨酸對大鼠血清抗氧化能力及脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響，旨在為異亮氨酸在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

選用48只SPF級初斷乳SD大鼠,許可證號SCYK(浙)20140001，平均初始體重65.75 g，雌雄各半，購買自浙江省實驗動物中心。按體重相近原則將雌雄大鼠均分為對照組和試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組雌雄大鼠各6只，雌雄大鼠分籠飼養(yǎng)于IVC籠具中。各處理組大鼠飲水含異亮氨酸的濃度分別為0、0.5、2.5、5 mg/mL，試驗期28d。大鼠飼喂基礎(chǔ)日糧，自由采食和飲水。

1.2 試驗藥品與試劑

L-異亮氨酸(1001064222)，C6H13NO2，純度≥99%，購自美國sigma公司；總谷胱甘肽試劑盒(20150703)和丙二醛試劑盒(20150711)，購自南京建成生物工程研究所，其他常規(guī)實際均為分析純。

1.3 試驗方法

大鼠飼養(yǎng)結(jié)束后，用乙醚麻醉，解剖暴露心臟，真空促凝管右心房采血，室溫放置30min后，3000r/min離心15min，分離血清，使用試劑盒檢測血清T-GSH和MDA水平。同時立即解剖取脾臟，多聚甲醛PBS液常溫固定24h以上，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，中性樹膠封片，Olympus BX51+DP73顯微攝影系統(tǒng)顯微觀察并攝影。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean±SD)表示，使用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析(ANOVA)，采用Dunnett-t檢驗進行顯著性差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 異亮氨酸對大鼠血清抗氧化能力的影響

異亮氨酸對SD大鼠血清T-GSH水平的影響見表1。表1結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗Ⅰ組雌鼠血清T-GSH水平顯著升高15.64%(P<0.05)，試驗Ⅱ、Ⅲ組雌鼠血清T-GSH水平無顯著變化(P>0.05)；試驗Ⅱ、Ⅲ組雄鼠血清T-GSH水平分別升高5.37%和13.26%，其中試驗Ⅲ組差異顯著(P<0.05)，試驗Ⅰ組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

異亮氨酸對SD大鼠血清MDA含量的影響見表2。由表2可見，與對照組相比較，試驗Ⅰ組雌鼠血清MDA含量顯著降低15.57%(P<0.05)，試驗Ⅱ、Ⅲ組雌鼠血清MDA含量無顯著變化(P>0.05)；試驗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組雄鼠血清MDA含量分別降低11.97%、25.12%和2.47%，其中試驗Ⅱ組差異顯著(P<0.05)。

表1 異亮氨酸對SD大鼠血清T-GSH水平的影響(n=6)

注:同列，肩標(biāo)“*”表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)“**”表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note:In the samecolumn, shoulder marked "*" mean significant difference (P<0.05), while with shoulder marked “**” indicated no difference (P<0.01).The same below.

表2 異亮氨酸對SD大鼠血清MDA水平的影響(n=6)

2.2 異亮氨酸對大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

異亮氨酸對雌性大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響見圖1。顯微鏡下可見，對照組雌性大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，白髓和紅髓結(jié)構(gòu)清晰，脾小結(jié)較多，動脈周圍淋巴鞘較厚，淋巴細(xì)胞排列密集(圖1-A)。與對照組相比，試驗Ⅰ組雌性大鼠脾臟白髓脾小結(jié)明顯增多，體積增大，動脈周圍淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞排列密集，紅髓脾索增寬，脾竇較為明顯(圖1-B)；試驗Ⅱ組雌性大鼠脾臟白髓脾小結(jié)體積稍有增大，動脈周圍淋巴鞘有所增厚，淋巴細(xì)胞排列較為緊密(圖1-C)；試驗Ⅲ組雌性大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)與對照組相比較變化不明顯(圖1-D)。

異亮氨酸對雄性大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響見圖2。顯微比較觀察可見，對照組雄性大鼠脾臟白髓和紅髓組織結(jié)構(gòu)正常，脾小結(jié)較多，體積較大，動脈周圍淋巴鞘較厚，淋巴細(xì)胞排列較為密集(圖2-A)。與對照組相比，試驗Ⅰ組雄性大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯變化，其脾小結(jié)較大，動脈周圍淋巴鞘較厚，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞較密集，脾索和脾竇結(jié)構(gòu)較清晰(圖2-B)；試驗Ⅱ組雄性大鼠脾臟白髓脾小結(jié)數(shù)量增多，體積明顯增大，脾動脈周圍淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞排列緊密(圖2-C)；試驗Ⅲ組雄性大鼠脾臟脾小結(jié)增多，體積有所增大，脾動脈周圍淋巴鞘較厚，淋巴細(xì)胞排列較為密集(圖2-D)。

3 結(jié)論與討論

研究表明，支鏈氨基酸(BCAA)是機體內(nèi)重要的能源物質(zhì)，具有促進蛋白質(zhì)合成及抑制其分解的作用，能限制多方面免疫功能的消弱和增加病原體的受損傷狀態(tài)[5]，也可作為氮源和碳骨架的供應(yīng)者用于合成其他的氨基酸，如谷氨酸的合成對免疫細(xì)胞的功能有重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，BCAA可調(diào)節(jié)線粒體的功能和超氧化物岐化酶的表達和活性，且可通過mTOR通路調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)量與活性，進而降低細(xì)胞的氧化損傷[6]。抗氧化酶可協(xié)同防止活性氧損傷，是生物體抗氧化的第一道防線，機體的氧化與抗氧化防御體系達到平衡時，機體細(xì)胞的損傷才能控制在最小程度[7]。楊兵等[8]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.3%異亮氨酸能顯著提高小香雞GSH-PX活性，降低體內(nèi)MDA濃度。本研究中雌雄大鼠血清抗氧化指標(biāo)的變化特點表明，飲水補充適量異亮氨酸可提高大鼠的血清抗氧化能力，并與動物性別有著密切關(guān)系。

脾臟是哺乳動物體內(nèi)最大的外周免疫器官，是具有免疫活性的T、B細(xì)胞移居和接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要部位，對細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞的吞噬功能均具有重要作用[9]。楊兵等[8]研究發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸對小香雞免疫功能具有一定調(diào)節(jié)作用，可提高溶菌酶、補體C3和C4的含量及免疫球蛋白水平等。本研究試驗組大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的變化特點顯示，飲水補充0.5%異亮氨酸對雌性大鼠脾臟結(jié)構(gòu)有明顯改善作用，其白髓脾小結(jié)增多、增大，動脈周圍淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞密集，紅髓脾索增寬，脾竇較明顯；補充2.5%異亮氨酸對雄性大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)則有明顯改善作用。結(jié)果顯示，飲水添加適量異亮氨酸對大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)育及機體免疫功能有較明顯地促進作用，且促進作用與動物的性別有明顯相關(guān)性，此結(jié)果與大鼠的血清抗氧化水平的變化規(guī)律一致，即飲水添加不同水平異亮氨酸對大鼠血清抗氧化能力及脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響不僅與異亮氨酸的添加量有關(guān)，而且與動物的性別密切相關(guān)。

研究表明，不同動物的不同生長階段所需異亮氨酸最適量皆有差異。就仔豬每天攝入的異亮氨酸量而言，中國瘦肉型生長肥育豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)推薦的10～20kg仔豬異亮氨酸每天需要量為5.0 g，NRC(1998)的相應(yīng)推薦值為6.3g。且人和動物的研究中均顯示，不同性別對營養(yǎng)物質(zhì)需求和敏感程度均有差異[10-11]。以上內(nèi)容為本研究雌雄大鼠異亮氨酸最適劑量的差異提供了合理的解釋。此外，本研究中雄性大鼠血清MDA含量，Ⅱ組顯著降低，Ι組、Ⅲ組無作用。Ι組MDA無顯著變化，是由于劑量不足，對血清的抗氧化作用不明顯，而Ⅲ組無作用原因可能是異亮氨酸量過高，氨基酸間平衡被打破。日糧中必需氨基酸( EAA) 的平衡效果越好, 飼養(yǎng)對象對日糧蛋白質(zhì)的利用率就越高[12-13]。例如，飼料中L-異亮氨酸水平過高或過低會降低花鱸的增重率和蛋白質(zhì)沉積率等，主要原因即是過高或過低的L-異亮氨酸水平打破了飼料中氨基酸的平衡，降低機體蛋白質(zhì)的合成效率[3]。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸同屬于支鏈氨基酸，支鏈氨基酸相互間也存在平衡。有研究表明，哺乳母豬及其仔豬日糧中纈氨酸為1.17%，異亮氨酸為0.94%，纈氨酸 ∶異亮氨酸 ∶亮氨酸為1.24 ∶1 ∶1.54的對生產(chǎn)性能效果最好[2]。

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(責(zé)任編輯：馬世堂)

Effect of Isoleucine on the Serum Antioxidant Levels and the Structure of Spleen in Rats

GONG Bi-shuang, REN Man, JIN Er-hui, LI Qian-qian, LI Xiu-rong, LI Sheng-he*

(College of Animal Science, AnHui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective:It is to study the effect of isoleucine on the serum antioxidant levels and tissue structure. Mothods:48 weaning healthy SD rats were randomly divided into four groups (n=12, equal male and female). Rats of the control group, experiment group I, II and III were treated with 0, 0.5, 2.5 and 5 mg/mL isoleucine supplemented in water. At the 28d of experiment period, the serum samples were obtained to measure total serum glutathione (T-GSH) and malondialdehyde (MDA) level; the spleen were collected to paraffin sections, HE staining, microstructure for observation. Results:Compared with the control group, the serum T-GSH levels were significantly increased (P<0.05) and the MDA level significantly decreased (P<0.05 ) in the experimental group I female rats and the experimental group III male rats. The microstructure photography shows that spleen of the experimental group I female rats and experimental group II male rats have greater splenic follicles, thicker lymphatic sheath surrounding the splenic artery and serried lymphocytes ranks. Conclusion:The results conclude that 0.5% isoleucine can increase antioxidant capacity and improve the structure of spleen in female rats and 2.5% isoleucine has significant effect on antioxidant capacity and the structure of spleen in male rats.

Isoleucine; Serum Antioxidant function; Spleen; Tissue structure

2015-07-06

國家自然科學(xué)基金(31501968)；安徽高校自然科學(xué)研究重點項目(KJ2015A296)；安徽省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(1504032001)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)基金(ZRC2014453)；安徽科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(108792015059)。

宮碧霜(1992-)，女，安徽省宿州市人，在讀碩士研究生，主要從事動物微量元素營養(yǎng)與健康研究。*通訊作者：李升和，教授，E-mal:lish@ahstu.edu.cn。

S816.7

A

1673-8772(2015)06-0001-05