黃　靜，王　琳，張括川，劉曉丹，趙寶華（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊050024）

?

E型產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達

黃靜，王琳，張括川，劉曉丹，趙寶華＊
（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊050024）

摘 要：ι毒素是是公認的引起羔羊、犢牛和家兔患腸毒血癥的主要毒素，為了減小其給畜牧業(yè)帶來重大損失，論文就ι毒素蛋白的構(gòu)建與表達進行研究，以期對其所引起疾病的預(yù)防及疫苗的研發(fā)提供參考。通過E型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組，利用PCR方法獲得大小為1 377bp的iota a基因和2 640bp的iota b基因；隨后將目的基因同pET-28a質(zhì)粒連接構(gòu)建重組載體，并將重組載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達，并通過SDS-PAGE、Western blot進行分析，發(fā)現(xiàn)Ia、Ib蛋白均成功進行了可溶性表達；最后利用Ni-NTA層析柱對重組蛋白進行純化，獲得了目的蛋白。

關(guān)鍵詞：E型產(chǎn)氣莢膜梭菌；ι毒素；構(gòu)建；表達

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）分布范圍廣，在土壤、污水、食品、人類糞便、腸道正常菌群中均有分布。它是動物和人類重要的病原菌之一，能引起食物中毒［1-3］。產(chǎn)氣莢膜梭菌共可產(chǎn)生至少16種毒素，根據(jù)4種主要致死性毒素（α、β、ε、ι）可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D、E 5種類型［4-5］。產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素只能由E型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，是4種致死性毒素中唯一的一種二元毒素，由Ia和Ib兩部分組成，能引起羔羊、犢牛和家兔患腸毒血癥［6-7］。Ia具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，是其產(chǎn)生毒性的關(guān)鍵部位，進入細胞后能夠破壞細胞骨架，從而使細胞發(fā)生裂解死亡。Ib是一種綁定組件，能形成七聚體結(jié)構(gòu)，與Ia發(fā)生綁定作用，負責(zé)將Ia轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用［8-10］。ι毒素主要通過破壞細胞骨架，影響細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、信息交換、能量傳遞，從而使細胞裂解死亡，腸道發(fā)生病灶性出血［11-13］。ι毒素引起的腸毒血癥每年給畜牧業(yè)帶來重大損失，對其防控和治療方面的研究已刻不容緩。本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建pET28a-Ia BL21 （DE3）、pET28a-Ib BL21（DE3）重組菌，誘導(dǎo)其克隆性表達獲得Ia、Ib蛋白，并對蛋白進行純化。為今后產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素基因疫苗和分子抗體的研究奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 E型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCIB10748）為北京伯天達生物科技有限公司產(chǎn)品，由本實驗室保存；大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21（DE3）、pET28a質(zhì)粒載體均由本實驗室保存。

1.1.2實驗動物 6周齡～8周齡Balb/c小鼠，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物中心。

1.1.3主要試劑 高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 15 000、卡那霉素、IPTG為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；SacⅠ、XhoⅠ為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Ni-NTA Agrose珠子為Qiagen公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、Tris Base、Glycine、過硫酸銨、2-巰基乙醇、溴酚藍、考馬斯亮藍G-250為寶泰克生物科技公司產(chǎn)品；HRP標記羊抗鼠IgG為Promega公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國Amresco公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒為北京全式金生物科技有限公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.1.4主要儀器設(shè)備 梯度PCR儀、臺式冷凍離心機為Eppendof公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為北京市六一儀器廠產(chǎn)品；超凈工作臺，全溫振蕩培養(yǎng)箱為SUKUN公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋；恒溫搖床；高壓滅菌鍋等。

1.2方法

1.2.1設(shè)計引物 參照GenBank公布的iota a、iota b基因序列設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2菌株的復(fù)蘇與基因組提取 將干粉保存的E型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株用液體LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)過夜，次日劃線LB固體平板，37℃過夜培養(yǎng)，第2天挑陽性克隆，接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃、180r/min培養(yǎng)過夜。將上述過夜搖培的菌液收集1mL～5mL于離心管中，12 000r/min離心1min，棄上清，去殘留的培養(yǎng)液按照細菌基因組提取試劑盒提取全基因組DNA。

1.2.3目的基因的獲取與重組載體的構(gòu)建 利用提取的全基因組為模板，在低溫環(huán)境下構(gòu)建iota a 和iota b基因PCR擴增反應(yīng)體系：將以上反應(yīng)體系加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進行擴增：94℃2min；94℃10s，65℃45s，72℃60s，30個循環(huán)；72℃10min。PCR擴增結(jié)束，10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的結(jié)果，并對目的基因進行切膠回收。

將回收的目的片段與pET28a質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建pET28a-Ia、pET28a-Ib重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。用含卡那霉素的LB固體平板，37℃過夜培養(yǎng)，第2天挑陽性克隆，接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃、180r/min培養(yǎng)過夜。

1.2.4重組克隆質(zhì)粒鑒定 次日按照質(zhì)粒小提試劑盒小量提取質(zhì)粒DNA。用SacⅠ、XhoⅠ雙酶切和PCR同時鑒定陽性克隆。并用10g/L的瓊脂糖凝膠分別對結(jié)果進行檢測。隨后將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果用DNA Man軟件與GenBank公布的基因序列進行同源性比對。

1.2.5產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素重組菌株的可溶性表達 將驗證正確的陽性重組菌過夜培養(yǎng)，次日接種于100mL含卡那霉素素的LB培養(yǎng)基中，37℃，搖培至對數(shù)期（OD 600nm=0.5～0.6）加IPTG至終濃度為1mmol/L，16℃誘導(dǎo)過夜表達重組蛋白。收集菌體加入6mL～8mL Lysis buffer溶解，超聲破碎30min，功率200 W，超聲8s，間歇10s，獲得破碎全液。4℃、12 000r/min離心10min，收集上清及沉淀，并進行SDS-PAGE及Western blot分析。

1.2.6產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素重組蛋白純化 純化前對Ni-NTA層析柱進行預(yù)處理，然后將收集到的菌液破碎后的上清，用0.22μm濾膜過濾，加入到已經(jīng)平衡好的層析柱內(nèi)，于4℃低速搖床上結(jié)合2h，使毒素重組蛋白結(jié)合到Ni-NTA珠子上。打開層析柱下蓋，放清液體。用5mL含不同濃度咪唑的Wash buffer對上柱蛋白進行洗滌，4℃搖床結(jié)合，10min/次，以除去雜蛋白，收集洗滌液，取少量進行SDS-PAGE檢測，并根據(jù)結(jié)果改變咪唑濃度，直至洗滌液中沒有雜蛋白出現(xiàn)為最佳洗滌效果。用1mL含不同濃度咪唑濃度的Elution solution對目的進行洗脫，4℃搖床結(jié)合，10 min/次，收集洗脫液，取少量進行SDS-PAGE檢測，根據(jù)洗脫效果，來逐步提高咪唑濃度加大洗脫力度。用Band Scan 6.0軟件分析目的蛋白表達量。

2　結(jié)果

2.1目的基因獲取結(jié)果

以提取全基因組為模板，在低溫環(huán)境下構(gòu)建iota a和iota b基因PCR擴增反應(yīng)體系，10g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可知分別獲得大小1 377bp、和2 640bp的目的片段，并將結(jié)果送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果與GenBank進行同源性比對。結(jié)果顯示正確，成功獲得目的基因。

2.2重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

2.2.1重組質(zhì)粒PCR驗證 分別以pET28a-Ia重組質(zhì)粒、pET28a-Ib重組質(zhì)粒為模板，進行PCR驗證，10g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，以2種重組質(zhì)粒為模板進行的PCR，分別獲得大小為1 377bp和2 460bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。并且測序結(jié)果經(jīng)比對與GenBank公布的基因序列結(jié)果一致。

圖1　PCR擴增目的基因結(jié)果Fig.1 PCR amplification of target gene

圖2　PCR鑒定陽性克隆結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of positive clones

2.2.2重組質(zhì)粒雙酶切驗證 將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ進行雙酶切驗證，并設(shè)置pET28a空白對照，10g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，pET28a-Ia重組質(zhì)粒雙酶獲得2條大小分別為5 369bp和1 377bp的條帶，pET28a-Ib重組質(zhì)粒雙酶獲得兩條大小分別為5 369bp和2 460bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

通過PCR和雙酶切驗證，同時證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，可以進行誘導(dǎo)表達。

圖3　雙酶切鑒定陽性克隆結(jié)果Fig.3 Double enzyme digestion results of positive clones

2.3重組菌誘導(dǎo)表達結(jié)果

利用濃度為1mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)陽性重組菌株pET28a-Ia（DE3）、pET28a-Ib（DE3），超聲裂解全液、上清及沉淀SDS-PAGE及Western blot結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，與對照組相比，重組菌pET28a-Ia（DE3）、pET28a-Ib（DE3）上清中出現(xiàn)大小分別為47.5ku、94.5ku的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。SDS-PAGE及Western blot均證明重組菌pET28a-Ia（DE3）、pET28a-Ib（DE3）成功進行可溶性表達。

圖4　重組菌誘導(dǎo)表達SDS-PAGE和Western blot結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analyses of recombinant bacteria

2.4重組蛋白純化結(jié)果

Ni-NTA層析柱對破碎后的菌液上清進行純化，5 mL咪唑濃度分別為100 mmol/L、300mmol/L的Wash buffer各洗脫2遍，再用咪唑濃度為500mmol/L的Elution buffer洗脫，取少量洗脫液進行SDS-PAGE分析，得到的檢測結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖5、圖6可知，成功獲得了純化結(jié)果良好的目的蛋白。

圖5　pET28a-Ia（DE3）純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE results of the purity of recombant pET28a-Ia（DE3）protein

圖6　pET28a-Ib（DE3）純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE results of the purity of recombant pET28a-Ia（DE3）protein

3　討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素是引起家畜猝死的主要毒素之一，因毒素類型多，致病速度快，使得其防治難度特別大。這也使得產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素成為了近些年科研工作者爭相研究的對象。近些年來，國內(nèi)外對產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D、E 5種類型的至少15種毒素進行了研究，特別是對α、β、ε、ι4種主要致死毒素的研究。4種主要致死性毒素中，對于α、β、ε毒素的研究較深入，早在2001年，趙寶華等［14］就對α毒素進行了深入的研究，并建立了抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α噬菌體單鏈抗體庫。韓廣偉等［15］對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素和ε毒素進行共表達，并對其免疫原性進行了研究。相對于其他3種主要致死性毒素而言，對ι毒素的研究，尤其是免疫原性的研究幾乎處于空白。

為此，本文采用分子技術(shù)，獲得了產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素兩個組成部分的目的基因iota a、iota b，經(jīng)PCR、雙酶切及測序分析證明，目的基因正確。利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了pET28a-Ia、pET28a-Ib重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中進行可溶性表達，并對蛋白純化條件進行優(yōu)化，最后經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析證明重組質(zhì)粒在E.coli中成功進行了可溶性表達。最后利用Ni-NTA層析柱法對目的蛋白進行純化，SDS-PAGE分析最終獲得純化良好的目的蛋白。這是國內(nèi)首次對產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素兩個組成蛋白Ia、Ib進行表達與純化，這為今后進一步進行免疫原性分析和產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素基因工程疫苗、小分子抗體的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻：

［1］ Garcia J P，Beingesser J，F(xiàn)isher D J，et al.The effect of Clostridium perfringens type C strain CN3685and its isogenic beta toxin null mutant in goats［J］.Vet Microbiol，2012，157：412-419.

［2］ Grass J E，Gould L H，Mahon B E.Epidemiology of foodborne disease outbreaks caused by Clostridium perfringens ［J］.Foodb Pathog，2013，10（2）：131-136.

［3］ Scharff R L.Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States［J］.Food Protect，2012，75 （1）：123-131.

［4］ 王 琳，趙宇亮，何建龍，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌ι毒素研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（11）：102-105.

［5］ Uzal F A，Vidal J E，McClane B A，et al.Clostridium perfringens toxins involved in mammalian veterinary diseases［J］. Open Toxinol，2010，3：24-42.

［6］ Jank T，Aktories K.Strain-alleviation model of ADP-ribosylation［J］.PNAS，2013，110（11）：4163-4164.

［7］ Tsurumura T，Tsumori Y，Qiu H，et al.Arginine ADP-ribosylation mechanism based on structural snapshots of iota-toxin and actin complex［J］.PNAS，2013，110（11）：4267-4272.

［8］ Stiles Bradley G，Wigelsworth Darran J，Popoff Michel R，et al.Clostridial binary toxins：iota and C2family portraits［J］. Front Cell Infect Microbiol，2011，1：1-14.

［9］ Nagahama M，Umezaki M，Oda M，et al.Clostridium perfringens iota-toxin binduces rapid cell necrosis［J］.Infect Immun，2011，79：4353-4360.

［10］ Uzal F A，Vidal J E，McClane B A，et al.Clostridium perfringens toxins involved in mammalian veterinary diseases［J］. Open Toxinol，2010，3：24-42.

［11］ Uzal F A，F(xiàn)reedman J C，Shrestha A，et al.Towards an understanding of the role of Clostridium perfringens toxins in human and animal disease［J］.Future Microbiol，2014，9（3）：361-377.

［12］ Stevens D L，Aldape M J，Bryant A E.Life-threatening clostridial infections［J］.Anaerobe，2012，18（2）：254-259.

［13］ Songer J G，Miskimmins D W.Clostridium perfringens type E enteritis in calves：two cases and a brief review of the literature［J］.Anaerobe，2004，10：239-242.

［14］ 趙寶華，許崇波.抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單鏈抗體基因的克隆和表達［J］.生物工程學(xué)報，2001，17（5）：543-547.

［15］ 韓廣偉，李兆才，宮曉煒，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素和ε毒素的共表達及其免疫原性的研究［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，4（6）：630-635.

Construction and Expression of Iota Toxin Recombinant Plasmid of Clostridium perfringens Type E

HUANG Jing，WANG Lin，ZHANG Kuo-chuan，LIU Xiao-dan，ZHAO Bao-hua
（College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang，Hebei，050024，China）

Abstract：Being known as the major cause of enterotoxaemia，Iota-toxin has caused great losses to animal husbandry yearly.To bring down the loss and to figure out the prevention and the vaccine of such disease，the expression and purification of Iota-toxin was recorded in this study.Clostridium perfringens type E genome was used as template for the PCR.The genetic engineering methods were used to construct the recombinant vector，the iota a gene（1 377bp）and iota b gene（2 640bp）were amplified fromC.perfringens type E genomc DNA by PCR.The genes were cloned into pET-28avector and expressed in E.coli BL21. The SDS-PAGE and Western blot analyses showed that the recombinant proteins were mainly in the form of soluble expressiors.The results indicated that the recombinant proteins possessed strong antigenicity which could be used as gene engineering vaccine and small molecular antibody.

Key words：Clostridium perfringens type E；iota toxin；construction；expression

作者簡介：黃 靜（1992-），女，山西大同人，學(xué)士，主要從事微生物學(xué)研究。＊通訊作者

基金項目：河北省自然科學(xué)基金項目（2009000290）

收稿日期：2014-12-10

中圖分類號：S852.6163；Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0062-05