王艷紅，張　波，李　波，張蓓蓓，于　倩，顏　超，華　慧，湯仁仙，鄭葵陽（徐州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，感染與免疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004）

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小鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的分離與鑒定

王艷紅，張波，李波，張蓓蓓，于倩，顏超，華慧，湯仁仙，鄭葵陽＊
（徐州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，感染與免疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004）

摘 要：為建立一種簡單可靠的小鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（MIBECs）分離培養(yǎng)方法，用Ⅳ型膠原酶進(jìn)行門靜脈灌注，取出肝內(nèi)膽管，用DNaseⅠ、pronase E和Ⅳ型膠原酶分類消化，小鼠肝內(nèi)膽管組織細(xì)小、均勻的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清（FBS）和10ng/mL表皮生長因子（EGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（ITS）的DMEM/F12培養(yǎng)基中。細(xì)胞貼壁后，利用細(xì)胞角蛋白19免疫熒光法鑒定目的細(xì)胞。在培養(yǎng)的過程中，用CCK8測(cè)定細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果顯示，成功分離出MIBECs，細(xì)胞純度約95%。細(xì)胞培養(yǎng)3d～7d內(nèi)呈對(duì)數(shù)生長狀態(tài)。以上結(jié)果表明本分離培養(yǎng)方法是一種簡單可靠的小鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞分離純化培養(yǎng)技術(shù)。

關(guān)鍵詞：小鼠；肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞；分離；鑒定；培養(yǎng)

肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（intrahepatic bile duct epithelial cells，IBECs）約占肝細(xì)胞總數(shù)的5%，其在肝內(nèi)膽道系統(tǒng)內(nèi)形成復(fù)雜的網(wǎng)狀管形結(jié)構(gòu)［1］。IBECs具有復(fù)雜的生理代謝功能，參與肝臟的代謝、排泌、免疫等生理過程，在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起一定的作用。研究表明，常見的肝內(nèi)膽管病變例如原發(fā)性硬化性膽管炎［2］、膽管癌［3］等疾病，都是以IBECs為病變靶位，進(jìn)而引起肝內(nèi)膽管上皮損傷。因此，了解正常IBECs的生物學(xué)特征和病變IBECs的病理特征對(duì)研究肝內(nèi)膽管病變的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療具有重要意義。由于小鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且MIBECs對(duì)各種試驗(yàn)具有重要的意義。目前，雖然已經(jīng)存在一些分離和鑒定MIBECs的方法，但這些方法均有一定的缺點(diǎn)，如分離步驟多、分離時(shí)間長、活性和收率相對(duì)較低、花費(fèi)多等［4］。為進(jìn)一步改善和解決這些問題，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，成功分離、鑒定、培養(yǎng)了MIBECs，為研究肝內(nèi)膽管的生理功能和相關(guān)疾病奠定了一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡Balb/c小鼠，平均體重18g，雌雄不拘，為揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心產(chǎn)品。

1.1.2試劑 DMEM/Fl2培養(yǎng)基、100×ITS為Gibco公司產(chǎn)品；pronase E為Roche公司產(chǎn)品；表皮生長因子（EGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）為PeproTech公司產(chǎn)品；100mL/L胎牛血（FBS）為四季青公司產(chǎn)品；青鏈霉素、Ⅰ型鼠尾膠原、Ⅵ型膠原酶、DNaseⅠ、CCK8為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗小鼠細(xì)胞角蛋白19抗體（CK19）為Santa Cruze公司產(chǎn)品；Alexa Fluor○R594驢抗兔IgG熒光二抗為introvigen公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1MIBECs的分離與培養(yǎng)

1.2.1.1小鼠經(jīng)麻醉后行門靜脈插管［5］，DMEM培養(yǎng)基驅(qū)除肝內(nèi)血液（圖1）。

圖1　肝臟門靜脈插管Fig.1 The hepatic portal vein intubation

1.2.1.2迅速取下連接針頭的肝臟，置于5g/L膠原酶中，循環(huán)灌注，約7min（圖2）。

圖2　肝臟循環(huán)灌注后Fig.2 The liver after circulation perfusion

1.2.1.3去掉肝臟表面包膜，初步去除肝細(xì)胞。

1.2.1.4震蕩去除大部分肝臟細(xì)胞，用彎頭鑷從膽囊處向下夾住大部分大膽管成分，去除雜質(zhì)，再次震蕩后得到完整的肝內(nèi)膽管樹（圖3）。

圖3　膽管樹Fig.3 Biliary tree

1.2.1.5用兩把彎鑷將膽管樹細(xì)小分支磨碎，20U/mL DNaseⅠ、1g/L pronase E和0.5g/L的Ⅳ型膠原酶37℃振蕩消化50min；再將剩余的大膽管剪碎成約1mm3，20U/mL DNaseⅠ、1g/L pronase E和0.5g/L的Ⅳ型膠原酶37℃振蕩消化1h。

1.2.1.6200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌2次后，800r/min離心5min，棄上清，將收集的細(xì)胞鋪到一個(gè)100mL玻璃培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。收集培養(yǎng)基，800r/min離心5 min，棄上清，將沉淀重懸于含100 mL/L FBS和10ng/mL EGF和HGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中［6］。

1.2.1.7用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法檢測(cè)MIBECs活細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞為無色透明，死細(xì)胞為藍(lán)色［7］。

1.2.1.8調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，接種于已用I型鼠尾膠原包被好的50mL塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，以后每2d換液1次。每天用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)和生長的基本情況。

1.2.2生長曲線的測(cè)定 將細(xì)胞以每孔5×104個(gè)/mL細(xì)胞接種于Ⅰ型鼠尾膠原包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積200μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于第2、3、5、7、9、11、13d［6，8］時(shí)各組每個(gè)觀測(cè)孔中分別加入CCK8試劑20μL，反復(fù)吹打均勻。把培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定OD值［8］。

1.2.3MIBECs的鑒定及純度鑒定

1.2.3.1免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定 48孔培養(yǎng)板中包被I型鼠尾膠原，MIBECs就會(huì)貼附在板上生長。培養(yǎng)6d后，在-20℃甲醇固定20min。PBS 洗2次，2min/次共3次，3g/L Tritonx-100通透5min，PBS洗滌3次。50mL/L FBS阻斷20℃，30min，PBS洗滌后加一抗兔抗小鼠CK19 （5μg/mL），4℃過夜。第2天PBS洗滌3次，12min/次，加Alexa Fluor○R594驢抗兔IgG熒光二抗（1∶1 000），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，滴加DAPI染料（1μg/mL），室溫靜置15min，PBS洗滌后每孔加100μL PBS放到熒光顯微鏡下拍照。

1.2.3.2采用熒光顯微技術(shù)鑒定細(xì)胞純度［9］，DAPI染料可將所有細(xì)胞核都顯示，而CK19能將MIBECs的細(xì)胞質(zhì)顯示出來，將兩種染色疊加在一起，即可判斷雙重染色的細(xì)胞是MIBECs，而只有單重染色的細(xì)胞不是MIBECs。計(jì)算每個(gè)視野下雙重染色的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞核染色數(shù)量，隨機(jī)抽取10個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞純度。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)

通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)觀察到，分離的MIBECs存活率約90%。細(xì)胞接種24h～48h見細(xì)胞貼壁，呈立方形單層生長，聚團(tuán)，形成大小不等的“細(xì)胞島”（圖4）。

圖4　鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.4 Morphological observation of intrahepatic bile duct epithelial cells in mice

2.2MIBECs鑒定及純化結(jié)果

免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中CK19的表達(dá)，檢測(cè)后熒光顯微鏡觀察顯示，膽管上皮細(xì)胞單層立方形（200×），呈團(tuán)聚狀分布。MIBECs細(xì)胞質(zhì)CK19呈紅色熒光的陽性表達(dá)，細(xì)胞純度達(dá)到了95%（圖5）。

圖5　肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞染色的顯微鏡觀察Fig.5 Microscopic examination of intrahepatic bile duct epithelial cells（IBEC）staining

2.3細(xì)胞的生長變化

2.3.1細(xì)胞形態(tài)的變化 MIBECs 24h～48h貼壁，在培養(yǎng)的第3天至第7天細(xì)胞聚團(tuán)生長、增殖迅速，以后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期；在培養(yǎng)第9天，細(xì)胞無明顯增生，雜質(zhì)細(xì)胞有增生，在培養(yǎng)第11天，有細(xì)胞出現(xiàn)空泡、拉絲、拉網(wǎng)及變形等現(xiàn)象，雜質(zhì)細(xì)胞生長旺盛。

2.3.2CCK8法測(cè)細(xì)胞生長曲線 MIBECs 24h～48h貼壁生長，在培養(yǎng)的第3天至第7天增殖快，呈對(duì)數(shù)增長狀態(tài)；在培養(yǎng)的7d～9d增殖慢，9d～13d進(jìn)入平臺(tái)期，無明顯增殖現(xiàn)象。MIBECs的生長曲線見圖6。

圖6　MIBECs生長曲線Fig.6 The growth curve of MIBECs

3　討論

IBECs僅占肝臟細(xì)胞總數(shù)的5%，其在肝內(nèi)構(gòu)成一個(gè)末端封閉的三維網(wǎng)狀導(dǎo)管系統(tǒng)。由于其數(shù)量少，無法灌流而且與其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝星狀細(xì)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞密度相近，是較難分離和培養(yǎng)的細(xì)胞［10］。小鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，且因其個(gè)體小、門脈系統(tǒng)的血管和膽管均很細(xì)小，因此較大鼠或兔子而言，MIBECs更難分離。然而其在膽管免疫防御中發(fā)揮了重要作用，因此其分離培養(yǎng)具有重要的意義。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IBECs的體外分離多通過門靜脈插管，以膠原酶進(jìn)行全肝灌流，解離肝細(xì)胞，然后進(jìn)行再次消化獲得肝內(nèi)膽管，酶消化后利用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法［8］或免疫分離法［4］進(jìn)行純化。然而，單用密度梯度離心法提純的膽管上皮細(xì)胞僅達(dá)10%，尚需進(jìn)一步純化。另外，免疫分離法價(jià)格昂貴且獲得的IBECs數(shù)量較少，且并不適宜在無免疫分離條件的實(shí)驗(yàn)室推廣。

本研究進(jìn)行了小鼠膽管上皮細(xì)胞分離條件的優(yōu)化，即先采用門靜脈膠原酶灌注肝臟先行消化之后成功分離出肝內(nèi)膽管樹，之后根據(jù)膽管的大小分類再次消化得到MIBECs。然而，小鼠的膽管樹體積較小，反復(fù)振蕩清洗易損失末端小膽管組織。這就要求我們采取適當(dāng)?shù)恼袷幜Χ群蜁r(shí)間，以求最大限度保護(hù)細(xì)胞不被振蕩丟棄。之后要去除肝外膽管組織并取下相應(yīng)的肝內(nèi)膽管進(jìn)行消化。因?yàn)榧?xì)胞消化時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的DNA使其粘連在一起，使得消化下來的細(xì)胞難以通過不銹鋼篩網(wǎng)，所以加入適量的DNaseⅠ可使粘連的細(xì)胞分散。而pronase E能水解纖維蛋白和黏蛋白，有助于死亡的細(xì)胞降解而有助于MIBECs的分離。在上述操作基礎(chǔ)上利用反復(fù)貼壁法來純化MIBECs，這是基于MIBECs在玻璃瓶中不易貼壁，而成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞相對(duì)容易貼壁的特性［11］。本研究將膠原酶消化后的細(xì)胞懸液置于玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h，經(jīng)過貼壁選擇后將細(xì)胞置于鼠尾膠包被好的塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，體外原代培養(yǎng)的MIBECs會(huì)失去分化和增殖的能力，所以需要適當(dāng)使用細(xì)胞外基質(zhì)以促進(jìn)其體外增殖和分化。Ⅰ型鼠尾膠原的膠狀物具有多孔的結(jié)構(gòu)，已有很多實(shí)驗(yàn)人員將其用于IBECs的體外培養(yǎng)，其有利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換，為體外細(xì)胞提供了良好的貼壁生長環(huán)境［12］。因此，我們選擇鼠尾膠包被好的塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)原代培養(yǎng)MIBECs。另外也有文獻(xiàn)稱，原代培養(yǎng)IBECs最好分離后1d～14d的細(xì)胞，這是出于對(duì)膽管上皮細(xì)胞形態(tài)、功能及生長調(diào)控等角度的考慮［13］。所以我們也觀察了原代MIBECs培養(yǎng)后形態(tài)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIBECs 24h～48h貼壁，在培養(yǎng)的第3天至第7天細(xì)胞聚團(tuán)生長、增殖迅速，以后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期；在培養(yǎng)第9天，細(xì)胞無明顯增生，雜質(zhì)細(xì)胞增生較多，在培養(yǎng)第11天，有細(xì)胞出現(xiàn)空泡、拉絲、拉網(wǎng)及變形等現(xiàn)象，雜質(zhì)細(xì)胞生長旺盛。CCK8法測(cè)細(xì)胞生長曲線也證實(shí)了MIBECs在培養(yǎng)的第3天至第7天增殖快，呈對(duì)數(shù)增長狀態(tài)；在培養(yǎng)的第7天至第9天增殖慢，第9天至第13天進(jìn)入平臺(tái)期，無明顯增殖現(xiàn)象。

在培養(yǎng)IBECs的研究中，國內(nèi)外研究者大多使用霍亂毒素、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、地塞米松、EGF和肝細(xì)胞生長因子等成分促進(jìn)細(xì)胞體外生長［14］，其成分復(fù)雜，并且價(jià)格昂貴。本研究去繁就簡，反復(fù)摸索后選用了EGF、HGF和ITS加入培養(yǎng)基，便即可以使細(xì)胞生長旺盛并能用于進(jìn)一步試驗(yàn)。本研究通過更簡單有效實(shí)用的方法得到純度較高、活性較好的MIBECs，可在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室推廣。這為體外研究MIBECs的生理及病變機(jī)制提供了良好的試驗(yàn)平臺(tái)。然而，細(xì)胞生長10d后雜質(zhì)細(xì)胞的增生和無法傳代生長仍然是困擾我們的一個(gè)問題。因此，如何優(yōu)化細(xì)胞并提高細(xì)胞的增殖能力，以達(dá)到我們的試驗(yàn)?zāi)康膶⑹俏覀円院蟮囊粋€(gè)研究方向。

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Isolation，Identification and Cultivation of Intrahepatic Bile Duct Epithelial Cells from Mouse

WANG Yan-hong，ZHANG Bo，LI Bo，ZHANG Bei-bei，YU Qian，YAN Chao，HUA Hui，TANG Ren-xian，ZHENG Kui-yang
（Laboratory of Infection and Immunity，Department of Pathogenic Biology and Immunology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu，221004，China）

Abstract：To establish a simple and reliable method for isolation and cultivation of intrahepatic bile duct epithelial cells（MIBECs）from mouse，the portal vein was perfused with typeⅣcollagenase，subsequently intrahepatic bile duct was taken out and then digested with DNaseⅠ，pronase E andⅣtype collagenase into small and uniform cells which were culured in DMEM/F12medium containing 100mL/L FBS and l0ng/ mL EGF，HGF and ITS.After cells attached to the sidewall，cells were identified by immunofluorescence assay of cytokeratin 19.During cell growth process，cell growth curve was determined by CCK8.The results showed that we have successfully isolated MIBECs by this method，and cell purity is about 95%. And CCK8tests showed MIBECs were in logarithmic growth state within cultured 3d-7d.These results suggest that this method is simple and reliable for isolation and purification and culture assay of MIBECs.

Key words：mouse；intrahepatic biliary epithelial cell；isolation；identification；culture

作者簡介：王艷紅（1987-），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事寄生蟲感染與免疫學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81171590，31302077）；家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（SKLVEB2013KFKT005）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（2014年）

收稿日期：2015-01-14

中圖分類號(hào)：R33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0043-04