王萌，張?；?，劉琪，張利

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 雅安　625014)

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蠶豆中5種內(nèi)源激素的高效液相色譜測定

王萌，張?；?，劉琪，張利

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 雅安625014)

摘要：采用高效液相色譜法分離和測定蠶豆中的吲哚乙酸、激動素、赤霉素、脫落酸和玉米素5種植物內(nèi)源激素.結(jié)果表明：選用80%甲醇作為樣品提取溶劑，經(jīng)石油醚和乙酸乙酯萃取，采用Diamonsil C18色譜柱進(jìn)行分離，以甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55；V/V)溶液為流動相，流速0.7 mL/min，波長254 nm的檢測條件下，蠶豆中各激素的分離效果理想，25 min內(nèi)全部出峰，加樣回收率達(dá)88.9%～97.3%.經(jīng)測定蠶豆中吲哚乙酸、激動素、赤霉素、脫落酸和玉米素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.2、35.0、332.9、2.4、9.23 ng/g，該方法滿足激素定量分析的要求，能快速、準(zhǔn)確的測定蠶豆內(nèi)源激素.

關(guān)鍵詞：蠶豆；高效液相色譜；內(nèi)源激素

第一作者：王萌(1985-)，女，講師，博士，研究方向為植物資源的評價與利用.E-mail:wangmeng.728@163.com

蠶豆(Viciafaba)屬于豆科，營養(yǎng)豐富，用途廣泛，是中國重要的糧食、蔬菜、副食、飼料和養(yǎng)地作物，如何調(diào)控其生長發(fā)育，進(jìn)而提高其產(chǎn)量與品質(zhì)近年來備受關(guān)注.植物激素對植物的種子萌發(fā)、生長、開花、成熟、衰老、休眠等活動起著間接或直接的調(diào)節(jié)、控制作用[1].目前，國內(nèi)對豆類作物的研究主要集中在礦質(zhì)元素、氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成份，對于內(nèi)源激素的研究比較少，而關(guān)于蠶豆的相關(guān)研究更為少見[2].

植物內(nèi)源激素含量低，性質(zhì)不穩(wěn)定，加之細(xì)胞中其他化合物的干擾，故測定方法必須十分靈敏和專一[3].目前植物內(nèi)源激素的檢測主要有生物鑒定法[4]、氣相色譜法[5]、 酶聯(lián)免疫法[6]、光譜測定法[7]、放射免疫法[8]和高效液相色譜法(HPLC)[9]等.HPLC法具有靈敏度高、專一性強、重復(fù)性好等特點，除了乙烯外，其它內(nèi)源激素均可以用HPLC法進(jìn)行檢測，且可以實現(xiàn)幾種激素的同時測定，應(yīng)用最為廣泛.因此，本研究擬采用HPLC法針對蠶豆中的吲哚乙酸(IAA)、激動素(KT)、赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)和玉米素(ZT)5種內(nèi)源激素進(jìn)行檢測分析，旨在為蠶豆品質(zhì)提高、性狀改良及開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用蠶豆種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物園中，挑選生長健壯的蠶豆植株，取葉片后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2儀器與試劑

LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；RM-220超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT124s電子天平.

吲哚乙酸、激動素標(biāo)準(zhǔn)品(成都科龍化工試劑廠，純度≥99.0%)；赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，純度≥99.0%)；脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，純度≥99.0%)；玉米素標(biāo)準(zhǔn)品(上海生物科技有限公司，純度≥99.0%)；石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸均為分析純；甲醇為色譜純；試驗用水為超純水.所以試劑在使用前均用0.45 μm微孔濾膜過濾.

1.3色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.075% 冰乙酸水溶液(體積比45∶55)等度洗脫，紫外檢測波長254 nm，柱溫20 ℃，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL.

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取IAA 1.10 mg、KT 1.22 mg、ABA 0.56 mg、ZT 1.06 mg，均用80%甲醇溶液溶解標(biāo)準(zhǔn)品定容于10.00 mL，GA34.44 mg定容于25.00 mL的容量瓶中，搖勻.分別從中精密吸取IAA 1.00 mL、KT 5.00 mL、GA310.00 mL、ABA 1.00 mL、ZT 1.00 mL置于25.00 mL的棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制IAA 4.40 μg/mL、KT 24.4 μg/mL、GA371.4 μg/mL、ABA 2.24 μg/mL、ZT 4.24 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.避光4℃下存放備用.

1.5樣品前處理

樣品前處理參照王世平等的方法并加以改進(jìn)與優(yōu)化[10].準(zhǔn)確稱取5.0 g蠶豆葉片，加入50 mL預(yù)冷的80%甲醇，冰浴研磨成漿，4 ℃避光冷浸過夜.抽濾后得上清液，殘渣再用80%甲醇提取2次(40 mL、20 mL各2 h)，合并上清液，40 ℃下旋轉(zhuǎn)減壓濃縮至干.分別用10 mL的磷酸緩沖液(pH=8.0)和10 mL的石油醚沖洗蒸餾瓶，合并沖洗液抽濾后，濾液用2倍體積的石油醚萃取3次，棄醚相.水相調(diào)整pH=8，等體積乙酸乙酯萃取3次，取酯相并調(diào)水相pH至8后等體積乙酸乙酯萃取3次，合并所有酯相40 ℃減壓濃縮至干，用80%甲醇溶解殘留物并定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析.

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件優(yōu)選

2.1.1流動相的確定利用高效液相色譜測定植物細(xì)胞內(nèi)源激素含量，由于所用色譜柱的種類不同，中所用的流動相種類差別較大.常用的流動相有甲醇-0.6%乙酸梯度洗脫[11]；乙腈-甲醇-0.6 %乙酸( 5∶50∶45，V/V)[12]；甲醇-水-乙酸(50∶45∶5，V/V)[13]；甲醇-乙腈-磷酸(15∶15∶70，V/V)[14]；乙腈-10 mmol/L乙酸鈉(20∶80，V/V)[15]，乙腈-0.02 mol/L醋酸緩沖液(25∶75，V/V)[16].通過綜合比較上述各種流動相經(jīng)過Diamonsil C18色譜柱對蠶豆5種內(nèi)源激素分離效果，優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)用甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55，V/V)溶液為流動相時，分離效果最好，且在25 min內(nèi)全部出峰.

2.1.2流速的確定分離時間隨流速的變化而變化，流速越大，各組分被洗脫出來時間就越短，即每分析一個樣品所耗時間越短，但流速太快，也會影響各組分的分離效果.基于流速要使各組分吸收峰能完全分離而又保留時間相對較短，在流動相、柱溫、檢測器波長等條件一定的情況下，使用等度洗脫分別考察了流速為0.4、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min時的分離效果，最終確定最佳流速選用0.7 mL/min.

2.1.3波長的確定檢測波長是影響液相色譜檢測結(jié)果的一個重要因素.首先對GA3和ABA標(biāo)準(zhǔn)液在紫外檢測器下進(jìn)行掃描，確定其吸收波長范圍，為液相色譜檢測波長的選擇提供依據(jù).檢測結(jié)果顯示GA3最大吸收波長為253 nm，ABA 最大吸收波長為257 nm.而對ZT、IAA、KT的甲醇溶液均在250～270 nm之間有最大響應(yīng)，綜合分析，考慮到UV-檢測器在254 nm處靈敏度最高，本試驗選用254 nm作為5種內(nèi)源激素的檢測波長，檢測效果最佳.

2.2線性關(guān)系考察

根據(jù)色譜條件，精密吸取5種激素的混合對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL依次進(jìn)樣，測定其峰面積(圖1).

以進(jìn)樣量x為橫坐標(biāo)，色譜峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，分別得5種激素回歸方程、保留時間、相關(guān)系數(shù)、線性范圍列于表1，表明5種激素在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

1：玉米素(ZT)；2：赤霉素(GA3)；3：激動素(KT)；4：3-吲哚乙酸(IAA)；5：脫落酸(ABA).圖1　5種內(nèi)源激素混合對照品的色譜圖Fig.1　Chromatogram of the five mixedhoemones standars

內(nèi)源激素回歸方程保留時間/min相關(guān)系數(shù)線性范圍/μgIAAy=(6.42×10-7)x-2.32×10-46.4550.99990.0044～0.11KTy=(2.13×10-7)x+1.04×10-222.4780.99980.0244～0.61GA3y=(1.84×10-5)x+4.53×10-24.1200.99970.07104～1.776ABAy=(1.53×10-7)x+2.18×10-48.3270.99990.00224～0.056ZTy=(2.41×10-7)x+7.70×10-414.0810.99970.00424～0.106

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗分別精密吸取同一混合供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果得IAA、KT、GA3、ABA和ZT的RSD分別為0.16%、0.5%、1.1%、3.9%、0.5%.

2.3.2穩(wěn)定性試驗取冷暗處放置的同一份供試品溶液，在同樣色譜條件下于0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣分析，每次10 μL測定色譜峰面積，IAA、KT、GA3、ABA和ZT的RSD分別為3.9%、0.7%、0.7%、3.1%、0.6%，結(jié)果顯示溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定.

2.3.3重復(fù)性試驗精密稱取同一份樣品5份，按照1.5項制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行含量測定.結(jié)果測得IAA、KT、GA3、ABA和ZT的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為1.0%、1.4%、4.8%、2.0%、0.7%，表明該方法重現(xiàn)性較好.

2.3.4回收率試驗采用加樣回收法，準(zhǔn)確稱取已知5種內(nèi)源激素含量的蠶豆葉片5份，每份5.000 g，每份樣品中均吸取1 mL IAA 0.052 μg/mL、KT 0.188 μg/mL、GA30.977 μg/mL、ABA 0.018 μg/mL和ZT 0.042 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.5項下方法進(jìn)行供試品制備，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行含量測定，重復(fù)3次計算回收率，其測定結(jié)果及RSD值參見表2.

2.4樣品測定

分別精密吸取對照品與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析.平行測定3次，采用外標(biāo)法計算蠶豆葉片中IAA、KT、GA3、ABA、ZT的含量，含量結(jié)果及RSD值見表3，HPLC色譜圖見圖2.

表2　5種激素的回收率

1：玉米素(ZT)；2：赤霉素(GA3)；3：激動素(KT)；4：3-吲哚乙酸(IAA)；5：脫落酸(ABA)圖2　蠶豆葉片中5種內(nèi)源激素的色譜圖Fig.2　Chromatogram of the five endogenoushoemones in Vicia faba

內(nèi)源激素IAAKTGA3ABAZT質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(ng·g-1)15.235.0332.92.49.23RSD/%3.95.716.141.271.35

3結(jié)論

本試驗通過優(yōu)化蠶豆中5種內(nèi)源激素的提取條件及色譜條件，建立了一種簡單、有效的運用HPLC同時檢測蠶豆中5種內(nèi)源激素的分析方法.選用甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55，V/V)溶液為流動相，檢測波長254 nm，流速0.7 mL/min時分離效果理想，加樣回收率達(dá)88.9 %～97.3 %.該方法滿足激素定量分析的測定要求，為進(jìn)一步檢查蠶豆生長發(fā)育過程中內(nèi)源激素的變化、激素代謝等相關(guān)研究提供了關(guān)鍵技術(shù).

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(責(zé)任編輯李辛)

Stimutaneous determination of five endogenous hormones in

Viciafababy high performance liquid chromatography

WANG Meng，ZHANG Hai-hui，LIU Qi，ZHANG Li

(Sichuan Agricultural University,Ya'an 625014,China)

Abstract：A high performance liquid chromatography was developed to separate and determine the five endogenous hormones including IAA,KT,GA3,ABA and ZT inViciafaba.The results showed that the five endogenous hormones were well separated in 25 min,and their recoveries were between 88.9% and 97.3% by using 80% methanol as the extraction solvent,then extracted by petroleum ether and ethyl acetate and the chromatographic conditions was as follows: Diamonsil C18chromatographic column,mobile phase formed as methanol and 0.075% acetic acid (V/Vratio of 45∶55 ),the flow rate at 0.7 mL/min,and the detection wavelength at 254 nm.The measurement showed that the content of IAA,KT,GA3,ABA and Zt was 15.2 ng/g,35.0 ng/g,332.9 ng/g,2.4 ng/g and 9.23 ng/g,respectively.The method can meet the demand of quantitative analysis of hormones and can be used to quickly and accurately separate and measure the content of endogenous hormones inViciafaba.

Key words：Viciafaba;high performance liquid chromatography;endogenous

收稿日期：2014-09-28；修回日期：2014-12-11

基金項目：四川省科技廳科技支撐計劃項目(2014FZ0056).

通信作者：張利，女，教授，博生生導(dǎo)師，研究方向為植物化學(xué)成分分析.E-mail:zhang8434@sina.com

中圖分類號：S 643.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)06-0058-04