周玲玲，王曉煒，蔣萍

(新疆農業(yè)大學林學與園藝學院 ，烏魯木齊830052)

阿克蘇核桃生產園鏈格孢菌核桃葉枯病的診斷

周玲玲，王曉煒，蔣萍*

(新疆農業(yè)大學林學與園藝學院 ，烏魯木齊830052)

核桃葉枯病是2010年在和田地區(qū)墨玉縣托乎拉鄉(xiāng)新發(fā)現(xiàn)的一種病害，近兩年在阿克蘇核桃園里也發(fā)現(xiàn)了同樣癥狀的病株。從阿克蘇核桃主要生產區(qū)新和縣、溫宿縣、阿克蘇市紅旗坡采集典型的核桃葉枯病病樣，3個點共切取分離病組織180塊，經過培養(yǎng)其中132塊病組織上長出同一種真菌——鏈格孢(Alternariasp.)。用單孢分離法純化分離物并對其進行致病性測定，結果表明,接種健康核桃葉片后所產生的癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀一致。通過形態(tài)學鑒定及分子生物學方法確定病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)。

阿克蘇；核桃；鏈格孢菌；葉枯病；診斷

核桃(JuglansregiaL.)作為新疆的第二大果樹，約占全疆林果業(yè)總面積的四分之一。到2012年時，種植面積達420萬畝，居全國第3位，產量近24萬t，主要集中分布在阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)[1]。然而，隨著這幾年核桃栽植面積的不斷擴大，并且大面積集中栽植單一品種，加之近幾年受到反常氣候的影響以及在核桃產業(yè)實際生產中缺乏科學栽培管理經驗等多方面因素的影響，病蟲害問題表現(xiàn)的日益突出。核桃葉枯病是2010年在和田地區(qū)墨玉縣托乎拉鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)的一種新病害，病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)[2]，該病主要為害核桃葉片，造成葉片的變黃焦枯，秋季十月就像火燒一樣，嚴重影響核桃的產量與質量。近幾年通過對阿克蘇地區(qū)核桃主要生產區(qū)核桃葉枯病的初步調查，田間發(fā)現(xiàn)了與和田地區(qū)墨玉縣一樣的典型病株。本研究采用組織分離法對采自新和縣、溫宿縣、阿克蘇市紅旗坡的典型核桃葉枯病病樣進行病原菌的分離培養(yǎng)，用單孢分離法純化分離物并對其進行致病性測定，通過形態(tài)學鑒定及分子生物學方法確定病原菌,從而明確阿克蘇地區(qū)核桃葉枯病是否也由同一種病原菌引起。

1 材料與方法

1.1 病樣、培養(yǎng)基

采集阿克蘇市、溫宿縣、新和縣3個地區(qū)典型新鮮病樣；PDA培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基。

1.2 方法

采用組織分離法分離具有典型癥狀的新鮮病樣，待分離菌物長出后3天，用尖端菌絲挑取法純化，然后單孢分離進一步純化直至獲得純培養(yǎng)[3-4]。將菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72h進行活化，配成1×106～8/mL孢子懸浮液，進行分離物的致病性測定：設針刺傷和無傷接種2個處理，每個處理重復3次，以無菌水作為對照。接種后，覆蓋滅菌濕脫脂棉，套塑料袋保濕48h，于28℃人工氣候箱保濕培養(yǎng)。以后每天觀察接種部位，并記錄接種部位變化，直至5天；對接種后發(fā)病的葉片進行病原菌再分離[5]，并對分離物純化鑒定。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及分離物單孢純化結果

從阿克蘇地區(qū)新和縣，溫宿縣，阿克蘇市3個地點采集典型核桃葉枯病病樣進行病組織分離，共切取了180塊組織，經過5d的培養(yǎng)，其中132塊組織塊上長出同一種真菌——鏈格孢(Alternariasp.)，如表1所示。分離到的菌物菌落初期為白色后期邊緣灰白色，菌落中央顏色變成灰黑色，呈絮狀，菌落蔓延生長。在WA平板上進行單孢純化，純化結果如圖1所示。

表1 阿克蘇地區(qū)核桃葉枯病病原菌分離結果

注：A、B菌物單孢分離后期；C菌物單孢分離前期

2.2 分離物的致病性測定及再分離結果

用代表分離物接種健康的核桃葉片，7d后有傷接種的開始發(fā)病,無傷接種沒有發(fā)病，15d后刺傷接種的葉片發(fā)病率達到100%，無傷接種的發(fā)病率為80%。無論是有傷還是無傷接種所產生的癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀一致，而對照組葉片有傷無傷均不發(fā)病。對發(fā)病的核桃葉片再分離[6]，共切取了120塊組織，經過3 d的培養(yǎng)，其中96塊組織塊上長出同1種真菌——鏈格孢(Alternariaspp.)，分離率達到80%。

2.3 核桃葉枯病病原菌的鑒定

選取3個具有代表性的菌株WS2-1、AKS2-2、XH2-3進行形態(tài)學鑒定。在PSA、PCA上的鏈格孢菌株的菌落形態(tài)無區(qū)別，在 PCA 平板上，26 ℃下，12h/12h黑暗與光照下培養(yǎng)5 d，菌落初期為白色，見光后菌落變?yōu)榘祷疑涟登嗪稚吘壈咨?，圓形、邊緣整齊，菌落背面暗褐色。產孢表型為具短分枝的孢子鏈；培養(yǎng)基內氣生菌絲發(fā)達，淡褐色至褐色，有隔，多分枝；分生孢子梗分隔，不分枝，淡褐色至褐色，合軸式延伸，大小(30.5～76.1)μm×(4.3～ 5.7)μm；分生孢子單生或短鏈生，常產生分枝的鏈，孢子倒棍棒形、卵形、倒梨形或橢圓形，淡褐色至褐色，表面光滑，具3～8個橫隔和1～4個縱、斜隔隔膜，分隔處略縊縮，孢身(11.4～31.7)μm×(4.8～13.1)μm。短喙圓柱形，淡褐色或近無色，(0～14.2)μm×(1.4～5.0)μm。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征與培養(yǎng)特性，初步鑒定為鏈格孢菌。

注：D分生孢子梗、E分生孢子

圖3 病原菌ITS區(qū)PCR擴增結果

通過ITS1F-ITS4引物對供試菌株進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得介于500 bp與750 bp之間的清晰條帶，經測序得到了長度為560 bp的rDNA ITS序列。將所測序列在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株B1、I-11及b2的序列與鏈格孢菌株的ITS序列同源性為99%。3個菌株在GenBank注冊的序列號分別為KJ004058，KJ004059，KJ004063(如圖3所示)。

3 小結與討論

鏈格孢菌(A.alternata)是許多植物上的病原菌，也可以腐生在土壤糞便和發(fā)霉的植物材料上[7]，寄生性相對較弱。在自然情況下常生于植物的枯死部分(病斑、傷、死部位等)或衰弱的組織上，種子內外，或腐生于多種有機物上或土壤中，在基質表面形成薄厚不同的暗色霉層[8]。

本項目經過實驗研究確定新疆阿克蘇地區(qū)的核桃葉枯病是由鏈格孢菌(Alternariaalternata)引起。這同2010年在新疆和田墨玉縣首次發(fā)現(xiàn)的核桃葉枯病的病原菌相同，并且發(fā)病癥狀也相似，發(fā)病初期均從核桃葉片的邊緣開始逐漸向葉內擴展。初期侵染點周圍開始產生褪綠病斑，病斑近圓形，漸漸葉組織壞死變?yōu)楹诤稚目莅?，有的有同心輪紋，發(fā)病后期葉片變黃枯焦，葉背面或葉正面產生墨綠色霉層，其為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。據(jù)報道，最早發(fā)現(xiàn)的由鏈格孢菌(A.alternata)引起的核桃葉部病害發(fā)生于1998年意大利北部的果園里，它的癥狀表現(xiàn)為有圓形病斑，并且其壞死斑帶黑暗色同心環(huán)的組織，病變部位可以蔓延至每片葉片的一半[9]。新疆阿克蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌核桃葉枯病的癥狀與此病相似，病原菌種類也相同。

此外鏈格孢菌不僅能引起核桃的葉部病害，還可引起其它木本植物的葉部發(fā)生病害，例如：枸杞葉斑病、阿月渾子褐斑病、蘋果斑點落葉病等[10-12]。

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Identification ofAlternariaalternataLeaf Spot ofJuglansregiaL. in Aksu Orchards

Zhou Lingling, Wang Xiaowei,Jiang Ping

(College of Forestry and Horticulture ,Xinjiang Agricultural University ,Urumqi 830052)

The leaf blight ofJuglansregiaL. in hotan region in 2010 on the township of the newly discovered a kind of disease, in recent years in aksuJuglansregiaL. garden also found the same symptoms strain. From xinhe county of aksuJuglansregiaL. main production area, wensu, aksu city collecting typical sample the leaf blight ofJuglansregiaL., taking the separation of three locations in the disease group 180 piece, After training with 132 pieces of disease tissue to grow the same kind of fungus-Alternariaspp. With a single spore isolates separation purification and determination of pathogenic, Results show that after vaccination healthJuglansregiaL. leaf symptoms consistent with the field of natural growth symptoms of the disease. The pathogenic fungus was identified asAlternariaalternateaccording to the morphological identification and molecular biological methods.

Aksu;JuglansregiaL.;Altenariasp.;Leaf spot; Identification

2015-04-07

新疆農業(yè)大學大學生創(chuàng)新項目(jqxtp72013168)；新疆維吾爾自治區(qū)森林培育重點學科資助

周玲玲(1992-)，女，本科生，E-mail：1577902269@qq.com；*通訊作者：蔣萍，女，副教授，主要從事林果病害的研究，E-mail：xj661105@sina.cn。

S436.64

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.005