周玲玲，王曉煒，蔣萍

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院 ，烏魯木齊830052)

阿克蘇核桃生產(chǎn)園鏈格孢菌核桃葉枯病的診斷

周玲玲，王曉煒，蔣萍*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院 ，烏魯木齊830052)

核桃葉枯病是2010年在和田地區(qū)墨玉縣托乎拉鄉(xiāng)新發(fā)現(xiàn)的一種病害，近兩年在阿克蘇核桃園里也發(fā)現(xiàn)了同樣癥狀的病株。從阿克蘇核桃主要生產(chǎn)區(qū)新和縣、溫宿縣、阿克蘇市紅旗坡采集典型的核桃葉枯病病樣，3個(gè)點(diǎn)共切取分離病組織180塊，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)其中132塊病組織上長(zhǎng)出同一種真菌——鏈格孢(Alternariasp.)。用單孢分離法純化分離物并對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果表明,接種健康核桃葉片后所產(chǎn)生的癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀一致。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)方法確定病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)。

阿克蘇；核桃；鏈格孢菌；葉枯??；診斷

核桃(JuglansregiaL.)作為新疆的第二大果樹(shù)，約占全疆林果業(yè)總面積的四分之一。到2012年時(shí)，種植面積達(dá)420萬(wàn)畝，居全國(guó)第3位，產(chǎn)量近24萬(wàn)t，主要集中分布在阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)[1]。然而，隨著這幾年核桃栽植面積的不斷擴(kuò)大，并且大面積集中栽植單一品種，加之近幾年受到反常氣候的影響以及在核桃產(chǎn)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中缺乏科學(xué)栽培管理經(jīng)驗(yàn)等多方面因素的影響，病蟲(chóng)害問(wèn)題表現(xiàn)的日益突出。核桃葉枯病是2010年在和田地區(qū)墨玉縣托乎拉鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)的一種新病害，病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)[2]，該病主要為害核桃葉片，造成葉片的變黃焦枯，秋季十月就像火燒一樣，嚴(yán)重影響核桃的產(chǎn)量與質(zhì)量。近幾年通過(guò)對(duì)阿克蘇地區(qū)核桃主要生產(chǎn)區(qū)核桃葉枯病的初步調(diào)查，田間發(fā)現(xiàn)了與和田地區(qū)墨玉縣一樣的典型病株。本研究采用組織分離法對(duì)采自新和縣、溫宿縣、阿克蘇市紅旗坡的典型核桃葉枯病病樣進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，用單孢分離法純化分離物并對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)方法確定病原菌,從而明確阿克蘇地區(qū)核桃葉枯病是否也由同一種病原菌引起。

1 材料與方法

1.1 病樣、培養(yǎng)基

采集阿克蘇市、溫宿縣、新和縣3個(gè)地區(qū)典型新鮮病樣；PDA培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基。

1.2 方法

采用組織分離法分離具有典型癥狀的新鮮病樣，待分離菌物長(zhǎng)出后3天，用尖端菌絲挑取法純化，然后單孢分離進(jìn)一步純化直至獲得純培養(yǎng)[3-4]。將菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72h進(jìn)行活化，配成1×106～8/mL孢子懸浮液，進(jìn)行分離物的致病性測(cè)定：設(shè)針刺傷和無(wú)傷接種2個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，以無(wú)菌水作為對(duì)照。接種后，覆蓋滅菌濕脫脂棉，套塑料袋保濕48h，于28℃人工氣候箱保濕培養(yǎng)。以后每天觀察接種部位，并記錄接種部位變化，直至5天；對(duì)接種后發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌再分離[5]，并對(duì)分離物純化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及分離物單孢純化結(jié)果

從阿克蘇地區(qū)新和縣，溫宿縣，阿克蘇市3個(gè)地點(diǎn)采集典型核桃葉枯病病樣進(jìn)行病組織分離，共切取了180塊組織，經(jīng)過(guò)5d的培養(yǎng)，其中132塊組織塊上長(zhǎng)出同一種真菌——鏈格孢(Alternariasp.)，如表1所示。分離到的菌物菌落初期為白色后期邊緣灰白色，菌落中央顏色變成灰黑色，呈絮狀，菌落蔓延生長(zhǎng)。在WA平板上進(jìn)行單孢純化，純化結(jié)果如圖1所示。

表1 阿克蘇地區(qū)核桃葉枯病病原菌分離結(jié)果

注：A、B菌物單孢分離后期；C菌物單孢分離前期

2.2 分離物的致病性測(cè)定及再分離結(jié)果

用代表分離物接種健康的核桃葉片，7d后有傷接種的開(kāi)始發(fā)病,無(wú)傷接種沒(méi)有發(fā)病，15d后刺傷接種的葉片發(fā)病率達(dá)到100%，無(wú)傷接種的發(fā)病率為80%。無(wú)論是有傷還是無(wú)傷接種所產(chǎn)生的癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀一致，而對(duì)照組葉片有傷無(wú)傷均不發(fā)病。對(duì)發(fā)病的核桃葉片再分離[6]，共切取了120塊組織，經(jīng)過(guò)3 d的培養(yǎng)，其中96塊組織塊上長(zhǎng)出同1種真菌——鏈格孢(Alternariaspp.)，分離率達(dá)到80%。

2.3 核桃葉枯病病原菌的鑒定

選取3個(gè)具有代表性的菌株WS2-1、AKS2-2、XH2-3進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。在PSA、PCA上的鏈格孢菌株的菌落形態(tài)無(wú)區(qū)別，在 PCA 平板上，26 ℃下，12h/12h黑暗與光照下培養(yǎng)5 d，菌落初期為白色，見(jiàn)光后菌落變?yōu)榘祷疑涟登嗪稚吘壈咨?，圓形、邊緣整齊，菌落背面暗褐色。產(chǎn)孢表型為具短分枝的孢子鏈；培養(yǎng)基內(nèi)氣生菌絲發(fā)達(dá)，淡褐色至褐色，有隔，多分枝；分生孢子梗分隔，不分枝，淡褐色至褐色，合軸式延伸，大小(30.5～76.1)μm×(4.3～ 5.7)μm；分生孢子單生或短鏈生，常產(chǎn)生分枝的鏈，孢子倒棍棒形、卵形、倒梨形或橢圓形，淡褐色至褐色，表面光滑，具3～8個(gè)橫隔和1～4個(gè)縱、斜隔隔膜，分隔處略縊縮，孢身(11.4～31.7)μm×(4.8～13.1)μm。短喙圓柱形，淡褐色或近無(wú)色，(0～14.2)μm×(1.4～5.0)μm。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征與培養(yǎng)特性，初步鑒定為鏈格孢菌。

注：D分生孢子梗、E分生孢子

圖3 病原菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)ITS1F-ITS4引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別獲得介于500 bp與750 bp之間的清晰條帶，經(jīng)測(cè)序得到了長(zhǎng)度為560 bp的rDNA ITS序列。將所測(cè)序列在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株B1、I-11及b2的序列與鏈格孢菌株的ITS序列同源性為99%。3個(gè)菌株在GenBank注冊(cè)的序列號(hào)分別為KJ004058，KJ004059，KJ004063(如圖3所示)。

3 小結(jié)與討論

鏈格孢菌(A.alternata)是許多植物上的病原菌，也可以腐生在土壤糞便和發(fā)霉的植物材料上[7]，寄生性相對(duì)較弱。在自然情況下常生于植物的枯死部分(病斑、傷、死部位等)或衰弱的組織上，種子內(nèi)外，或腐生于多種有機(jī)物上或土壤中，在基質(zhì)表面形成薄厚不同的暗色霉層[8]。

本項(xiàng)目經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究確定新疆阿克蘇地區(qū)的核桃葉枯病是由鏈格孢菌(Alternariaalternata)引起。這同2010年在新疆和田墨玉縣首次發(fā)現(xiàn)的核桃葉枯病的病原菌相同，并且發(fā)病癥狀也相似，發(fā)病初期均從核桃葉片的邊緣開(kāi)始逐漸向葉內(nèi)擴(kuò)展。初期侵染點(diǎn)周圍開(kāi)始產(chǎn)生褪綠病斑，病斑近圓形，漸漸葉組織壞死變?yōu)楹诤稚目莅?，有的有同心輪紋，發(fā)病后期葉片變黃枯焦，葉背面或葉正面產(chǎn)生墨綠色霉層，其為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。據(jù)報(bào)道，最早發(fā)現(xiàn)的由鏈格孢菌(A.alternata)引起的核桃葉部病害發(fā)生于1998年意大利北部的果園里，它的癥狀表現(xiàn)為有圓形病斑，并且其壞死斑帶黑暗色同心環(huán)的組織，病變部位可以蔓延至每片葉片的一半[9]。新疆阿克蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌核桃葉枯病的癥狀與此病相似，病原菌種類也相同。

此外鏈格孢菌不僅能引起核桃的葉部病害，還可引起其它木本植物的葉部發(fā)生病害，例如：枸杞葉斑病、阿月渾子褐斑病、蘋果斑點(diǎn)落葉病等[10-12]。

[1]新疆維吾爾自治區(qū)統(tǒng)計(jì)局. 新疆統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京：中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社, 2013.

[2]徐陽(yáng),劉雪峰,蔣萍,等.和田地區(qū)核桃葉斑病病原菌的鑒定[J].西部林業(yè)科學(xué),2012,41(3):102-105.

[3]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998:24-151.

[4]張?zhí)煊? 中國(guó)真菌志: 鏈格孢屬[M]. 北京: 科學(xué)出版社,2003:1-281.

[5]曲文文,楊克強(qiáng),劉會(huì)香,等.山東省核桃主要病害及其綜合防治[J].植物保護(hù),2011.37 (2) :136-140.

[6]于占晶,侯曉杰,崔建州,等.壺瓶棗褐斑病病原菌的鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2010,40(1):7-13.

[7]吳澤民,李宏開(kāi),束慶龍.現(xiàn)在林業(yè)研究方法[M]. 北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1999：169.

[8]張?zhí)煊?中國(guó)真菌志16卷 鏈格孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社,2003：32-36.

[9]A. Belisario, E. Forti, and L. Corazza et al. First Report of Alternaria alternata Causing Leaf Spot on English Walnut Plant Disaese，1999，83:696.

[10]姜海燕. 枸杞葉枯病病原菌研究[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

[11]楊書宇,孫淑釵,潘桂敏,等.阿月渾子褐斑病病原菌生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,39(19):11472-22473.

[12]張彩霞,陳瑩,李壯,等.蘋果斑點(diǎn)落葉病致病菌的鑒定及生物學(xué)特性研究[J].生物技術(shù), 2011, 21(4): 58-61.

Identification ofAlternariaalternataLeaf Spot ofJuglansregiaL. in Aksu Orchards

Zhou Lingling, Wang Xiaowei,Jiang Ping

(College of Forestry and Horticulture ,Xinjiang Agricultural University ,Urumqi 830052)

The leaf blight ofJuglansregiaL. in hotan region in 2010 on the township of the newly discovered a kind of disease, in recent years in aksuJuglansregiaL. garden also found the same symptoms strain. From xinhe county of aksuJuglansregiaL. main production area, wensu, aksu city collecting typical sample the leaf blight ofJuglansregiaL., taking the separation of three locations in the disease group 180 piece, After training with 132 pieces of disease tissue to grow the same kind of fungus-Alternariaspp. With a single spore isolates separation purification and determination of pathogenic, Results show that after vaccination healthJuglansregiaL. leaf symptoms consistent with the field of natural growth symptoms of the disease. The pathogenic fungus was identified asAlternariaalternateaccording to the morphological identification and molecular biological methods.

Aksu;JuglansregiaL.;Altenariasp.;Leaf spot; Identification

2015-04-07

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(jqxtp72013168)；新疆維吾爾自治區(qū)森林培育重點(diǎn)學(xué)科資助

周玲玲(1992-)，女，本科生，E-mail：1577902269@qq.com；*通訊作者：蔣萍，女，副教授，主要從事林果病害的研究，E-mail：xj661105@sina.cn。

S436.64

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.005