路青瑜，李 敏，孫黔云

（1．貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2．貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550002；3．貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州貴陽(yáng) 550002）

補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)變化及干預(yù)研究

路青瑜1，2，李 敏3，孫黔云2

（1．貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2．貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550002；3．貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州貴陽(yáng) 550002）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R322．12；R284．1；R329．2；R341；R392.11；R973.2

摘要：目的 研究補(bǔ)體旁路激活致微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)的變化及干預(yù)。方法 采用眼鏡蛇毒因子激活血清補(bǔ)體旁路途徑。將旁路活化的血清作用于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過ELISA檢測(cè)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM的表達(dá)，采用NO試劑盒檢測(cè)NO水平，并進(jìn)一步研究吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）、白藜蘆醇對(duì)以上指標(biāo)變化的影響。結(jié)果 微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)補(bǔ)體旁路活化產(chǎn)物刺激后，P-selectin、VWF的表達(dá)快速上調(diào)，其高峰時(shí)間為15 min，而纖溶功能分子t-PA、PAI-1也隨后出現(xiàn)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，與凝血功能相關(guān)的組織因子TF的表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，而血栓蛋白TM及NO的表達(dá)下降。PDTC、白藜蘆醇對(duì)P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF上調(diào)表達(dá)具有抑制作用，對(duì)NO下調(diào)表達(dá)具有干預(yù)作用。而白藜蘆醇能使TM的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。結(jié)論 補(bǔ)體旁路活化產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血功能相關(guān)分子表達(dá)的變化，而PDTC、白藜蘆醇對(duì)此種變化具有一定的影響。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)體；補(bǔ)體旁路活化；內(nèi)皮細(xì)胞；纖溶；凝血；PDTC；白藜蘆醇

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．025．html

在膿毒癥、急性肺損傷、缺血／再灌注損傷、多器官功能衰竭等臨床急危重癥與病理?yè)p傷中往往伴隨有纖溶凝血功能的改變和失調(diào)以及廣泛的微血栓形成。而這些病理變化與內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）功能受損密切關(guān)聯(lián)。近年來(lái)研究表明，補(bǔ)體在上述臨床急危重癥與病理?yè)p傷中扮演了重要的角色［1－2］。補(bǔ)體旁路活化會(huì)造成微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，表達(dá)黏附分子和炎癥介質(zhì)，從而可能導(dǎo)致炎癥和組織損傷［3－4］。本文研究了補(bǔ)體旁路激活對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血功能相關(guān)分子表達(dá)的變化及PDTC、白藜蘆醇的干預(yù)作用。

1　材料與方法

1．1材料 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascu-lar endothelial cells，HMEC）由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰井a(chǎn)品；人P-selectin檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；人VWF（von Willebrand factor）、

t-PA（tissue plasminogen activator）、PAI-1（plasmino-gen activator inhibitor）、TF（tissue factor）檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Assaypro公司；人TM（thrombomod-ulin）試劑盒購(gòu)自上海鑫樂生物科技有限公司；NO （nitric oxide）試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；吡咯烷二硫氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）、白藜蘆醇（resveratrol，Res）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；正常人血清（normal human serum，NHS）由本實(shí)驗(yàn)室多名健康志愿者獻(xiàn)血制備而成，分裝后凍存于－80℃，經(jīng)補(bǔ)體活性檢測(cè)正常，備用；滅活人血清（inactivated normal human serum，INHS）由NHS于56℃孵育30 min而得；眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）的制備和激活補(bǔ)體活性測(cè)定同文獻(xiàn)［5］；其余試劑均為符合實(shí)驗(yàn)要求的分析純。

1．2儀器 Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Ther-mo公司）；Nikon TS100倒置相差顯微鏡（日本Ni-kon公司）；Milli Q超純水系統(tǒng)和Elix純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Molecular Devices Spectra MAX-190酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；5810R冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Revco超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）。

1．3方法

1．3．1內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3．2血清活化 參照前期已發(fā)表文獻(xiàn)［3］的方法，將NHS與CVF（6.5×104U·L－1）等體積混合，在37℃水浴孵育30 min制成CAC（CVF-actived complement）備用。實(shí)驗(yàn)以INHS與CVF的孵育混合物作為對(duì)照。

1．3．3CAC對(duì)HMEC纖溶凝血相關(guān)蛋白分子表達(dá)的影響 將HMEC以1×104cells·well－1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，加入140 μL無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，再加入60 μL CAC至200 μL，分別孵育不同時(shí)間，取5、15、30、60 min上清測(cè)定P-selectin、VWF，取1、6、12、24 h上清測(cè)定t-PA、PAI-1、TF、TM，上述各指標(biāo)的測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置滅活血清對(duì)照組及血清本底對(duì)照組（negative control，NC）。

1．3．4CAC對(duì)HMEC表達(dá)NO的影響 將HMEC 以1×105cells·well－1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，后續(xù)操作同“1．3．3”，分別孵育12、24、48 h，取上清按試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定NO。

1．3．5PDTC、Res對(duì)CAC刺激HMEC表達(dá)P-selec-tin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM變化的影響 將HMEC以1×104cells·well－1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，分別加入含不同濃度PDTC、Res的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基140 μL預(yù)處理細(xì)胞1 h，再加入60 μL CAC，37℃孵育不同時(shí)間取上清檢測(cè)P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM。

1．3．6PDTC、Res對(duì)CAC刺激HMEC表達(dá)NO的影響 將HMEC以1×105cells·well－1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，后續(xù)操作同1．3．5，37℃孵育48 h，取上清測(cè)定NO。

2　結(jié)果

2．1CAC對(duì)HMEC纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)的影響

2．1．1CAC對(duì)HMEC表達(dá)P-selectin、VWF的影響補(bǔ)體旁路活化產(chǎn)物CAC刺激HMEC后能使P-se-lectin、VWF的表達(dá)瞬時(shí)上調(diào)。P-selectin的表達(dá)變化與之前研究結(jié)果［3］類似，在5 min即有明顯上調(diào)，15 min時(shí)達(dá)到峰值（數(shù)據(jù)未列出）。而VWF的表達(dá)高峰在15 min，但在5 min時(shí)基本沒變化（Fig 1）。

2．1．2CAC對(duì)HMEC表達(dá)t-PA、PAI-1的影響CAC刺激HMEC后，t-PA、PAI-1的表達(dá)均持續(xù)上調(diào)（數(shù)據(jù)未列），與之前研究結(jié)果［6］類似。其中，24 h時(shí)間點(diǎn)刺激組t-PA為（1.941±0.468）μg·L－1，對(duì)照組t-PA為（1.185±0.179）μg·L－1，兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。刺激組t-PA／PAI-1比值在1 h時(shí)間點(diǎn)有一個(gè)明顯的上調(diào)（P＝0.06）（Fig 2）。

Fig 1 Expression of VWF after HMEC exposure to CAC（n＝4）

Fig 2 Expression of t-PA and PAI-1 after HMEC exposure to CAC（n＝4）

2．1．3CAC對(duì)HMEC表達(dá)TF、TM、NO的影響CAC刺激HMEC后，TF的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，TM的表達(dá)在6 h時(shí)間點(diǎn)后下調(diào)（Fig 3）。而刺激組NO的表達(dá)下調(diào)（數(shù)據(jù)未列），與之前研究結(jié)果［3］類似。其中，48 h刺激組NO濃度為（2.297±0.650）μmol· L－1，對(duì)照組NO濃度為（4.966±1.823）μmol·L－1，兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2．2PDTC和Res對(duì)HMEC纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)變化的影響

2．2．1PDTC和Res對(duì)HMEC表達(dá)P-selectin、VWF的影響 PDTC和Res對(duì)CAC刺激HMEC表達(dá)P-se-lectin、VWF均具有干預(yù)作用（Fig 4）。其中，高濃度的PDTC和3個(gè)濃度的Res對(duì)P-selectin的表達(dá)具有明顯抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），而低劑量的PDTC對(duì)VWF表達(dá)具有明顯抑制作用（P＜0.05）。

Fig 3 Expression of TF and TM after HMEC exposure to CAC（n＝4）

Fig 4 Effect of PDTC and Res on expressions of P-selectin and VWF after HMEC exposure to CAC（n＝4）

Fig 5 Effect of PDTC and Res on expressions of t-PA and PAI-1 after HMEC exposure to CAC（n＝4）

2．2．2PDTC和Res對(duì)HMEC表達(dá)t-PA、PAI-1的影響 PDTC和Res對(duì)補(bǔ)體活化產(chǎn)物CAC刺激HMEC表達(dá)t-PA、PAI-1均具有干預(yù)作用（Fig 5）。其中，Res對(duì)t-PA表達(dá)的上調(diào)具有明顯的抑制作用（P＜0.01），中、高劑量的PDTC對(duì)PAI-1上調(diào)表達(dá)具有明顯的抑制作用（P＜0.05），Res能明顯抑制t-PA／PAI-1比值的上調(diào)（P＜0.01）（Fig 5）。

2．2．3PDTC和Res對(duì)HMEC表達(dá)TF、TM和NO的影響 PDTC和Res對(duì)CAC刺激HMEC上調(diào)表達(dá)TF具有抑制作用。低劑量的Res能明顯促進(jìn)TM的下調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。高劑量的PDTC及3個(gè)濃度的Res對(duì)NO的下調(diào)表達(dá)有明顯干預(yù)作用（P＜0.01）（Fig 6）。

3　討論

本研究采用CVF激活補(bǔ)體旁路途徑來(lái)刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞。CVF是從眼鏡蛇毒中分離純化出來(lái)的一種高度特異的補(bǔ)體旁路激活蛋白，與補(bǔ)體C3b有高度的同源性，其在血清中能與B因子特異結(jié)合，經(jīng)過D因子識(shí)別和酶切，進(jìn)而形成的C3／C5轉(zhuǎn)化酶CVF·Bb可持續(xù)激活補(bǔ)體旁路，產(chǎn)生C3a、C3b、C5a以及攻膜復(fù)合物等多種活化產(chǎn)物。

Fig 6 Effect of PDTC and Res on expressions of TF，TM and NO after HMEC exposure to CAC（n＝4）

研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞受到CAC刺激后，P-selectin、VWF表達(dá)瞬時(shí)上調(diào)，且均在15 min時(shí)達(dá)到峰值，但P-selectin的表達(dá)在5 min時(shí)明顯上調(diào)，而此時(shí)VWF的表達(dá)基本未變化。P-selectin、VWF分別作為內(nèi)皮細(xì)胞活化及內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志，均位于內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade內(nèi)，以上結(jié)果提示兩者的釋放調(diào)控機(jī)制存在差異。纖溶功能相關(guān)指標(biāo)t-PA、PAI-1明顯上調(diào)，t-PA／PAI-1比值在1 h明顯升高，提示纖溶功能的改變，而我們之前的研究也表明補(bǔ)體旁路的激活會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能分子的變化［6］。生理?xiàng)l件下，t-PA與PAI-1按1∶1形成穩(wěn)定的復(fù)合物，當(dāng)受到炎癥分子等的刺激時(shí)，纖溶局部功能失調(diào)，引起血栓形成。因此，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了CAC刺激HMEC可能會(huì)導(dǎo)致纖溶功能的失調(diào)。組織因子TF是凝血因子VII／VIIa的受體和輔助因子，具有激活凝血因子、促進(jìn)血小板聚集等功能。在本研究中，TF的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，提示了細(xì)胞表面凝血功能的變化。TM是細(xì)胞表面蛋白C抗凝血系統(tǒng)的重要組成成份，可作為血管內(nèi)皮損傷的分子標(biāo)記物［7－9］。有研究表明低密度脂蛋白、同型半胱氨酸處理內(nèi)皮細(xì)胞后TM的表達(dá)會(huì)上調(diào)［10－11］。而本實(shí)驗(yàn)中TM的表達(dá)下調(diào)，這提示了內(nèi)皮細(xì)胞表面抗凝血功能的下降。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO明顯減少。NO是體內(nèi)重要的信號(hào)及功能分子，與炎癥、凝血密切相關(guān)，其表達(dá)的變化是內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的重要標(biāo)志［12］。以上結(jié)果表明，補(bǔ)體旁路激活會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)的變化，從而可能導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血功能的失調(diào)。

PDTC和Res的干預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)P-selectin、 VWF、t-PA、PAI-1、TF上調(diào)表達(dá)具有抑制作用，對(duì)NO下調(diào)表達(dá)具有干預(yù)作用。值得注意的是，Res對(duì)TM的下調(diào)表達(dá)具有促進(jìn)作用。PDTC是NF-κB的特異抑制劑，能夠通過阻止Iκb的磷酸化降解，阻礙NF-κB的p65、p50亞基向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移等多種途徑抑制NF-κB的活化，進(jìn)而抑制炎癥分子的表達(dá)。而Res對(duì)NF-κB及NADPH氧化酶的活化具有抑制作用［13］，從而能夠明顯對(duì)抗氧化應(yīng)激造成的損傷。本研究中，PDTC、Res對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血相關(guān)分子的表達(dá)變化具有一定的影響，總體上評(píng)價(jià)，Res的作用優(yōu)于PDTC。上述研究結(jié)果為深入開展相關(guān)的調(diào)控機(jī)制及干預(yù)研究提供了線索和參考。

本研究表明，補(bǔ)體旁路激活會(huì)導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血相關(guān)分子的表達(dá)變化及潛在的功能失調(diào)，而PDTC、白藜蘆醇對(duì)此種變化具有一定的干預(yù)作用，這有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)炎癥情況下纖溶凝血功能改變的發(fā)生機(jī)制，并能為臨床治療新策略及新藥的篩選和研發(fā)提供參考依據(jù)和適宜的細(xì)胞模型。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心孫黔云研究員實(shí)驗(yàn)室完成。）

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Expression of coagulation-and fibrinolysis-related molecules of endothelial cells induced by activated complement alternative pathway and intervention

LU Qing-yu1，2，LI Min3，SUN Qian-yun2
（1．College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2．Key Laboratory of Chemistry for Natural Products，Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China；3．General Ward，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China）

Abstract：Aim To investigate the change of molecu-lar expression related to coagulation and fibrinolysis in human microvascular endothelial cells（HMEC）in-duced by activated complement alternative pathway and effect of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC）and res-veratrol on intervention．Methods Normal human se-rum was activated by cobra venom factor（CVF）．After exposure of HMEC to activated complement for various times，supernatant was removed and assayed for ex-pressions of P-selectin，VWF，t-PA，PAI-1，TF，TM，and NO by using reagent kits．The expressions of the above molecules in HMEC pretreated with PDTC and resveratrol were also investigated．Results P-selectin and VWF were rapidly released by endothelial cells and the expression reached the peak at the time point of 15 min．The expressions of t-PA，PAI-1，and TF were continuously upregulated，whereas NO and TM were decreased．PDTC and resveratrol inhibited the upregulation of P-selectin，VWF，t-PA，PAI-1 and TF，and intervened the downregulation of NO．Res-veratrol further downregulated the expression of TM．Conclusion Activated complement alternative path-way can influence the expression of molecules related to coagulation and fibrinolysis in HMEC，and PDTC and resveratrol can affect this change．

Key words：complement；activation of the complement alternative pathway；endothelial cells；fibrinolysis；co-agulation；PDTC；resveratrol

作者簡(jiǎn)介：路青瑜（1988－），女，碩士生，研究方向：天然藥物成分及生理活性，E-mail：756291505＠qq．com；孫黔云（1968－），男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生化藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，Tel：0851-83805095，F(xiàn)ax：0851-83805081，E-mail：sunqy＠hotmail．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 31060124、81260494）；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（黔省專合字2006-65號(hào)和2012-9號(hào)）

收稿日期：2015－05－29，修回日期：2015－06－27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1142－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．023