劉 里，成飛翔

（曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南曲靖 655011）

光譜法研究頭孢克肟與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里，成飛翔

（曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南曲靖 655011）

Study on interaction between cefixime and bovine serum albumin by spectrometry

LIU Li，CHENG Fei-xiang
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011，China）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．035．html

頭孢克肟（cefixime，CE）是常用消炎藥，目前未見(jiàn)用光譜法研究CE與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的報(bào)道，以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機(jī)制探討上，而本文在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的情況下從更多方面系統(tǒng)地研究了CE 與BSA的結(jié)合反應(yīng)，除了常規(guī)的作用機(jī)制的研究，還深入探討了3個(gè)不同溫度下兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合力類型、結(jié)合部位、藥物協(xié)同作用以及對(duì)BSA構(gòu)象的影響等。這些研究對(duì)于闡明CE在機(jī)體內(nèi)的傳輸、代謝過(guò)程及藥理作用具有有益的參考意義。

1　材料與方法

1．1儀器與試劑 F-4600熒光光譜儀（日本日立公司），測(cè)定參數(shù)：狹縫寬度10．0 nm，光電倍增管負(fù)高壓為400 V；

Cary50型紫外可見(jiàn)光譜儀（美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司）；pHS-3C精密酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；超級(jí)恒溫水浴（DHG-9035A型，上海一恒科技有限公司）。牛血清白蛋白（BSA，上?？瑯由锛夹g(shù)有限公司）；頭孢克肟（97%，百靈威科技有限公司）；其它試劑均為分析純，經(jīng)檢測(cè)在測(cè)量波段均無(wú)熒光雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1．2方法 于10 mL的比色管中依次加入1.0×10－5mol ·L－1的BSA 1.0 mL和不同體積的9.854×10－5mol·L－1的頭孢克肟溶液，0.5 mol·L－1NaCl溶液2．0mL（為維持體系的離子強(qiáng)度）和0.1 mol·L－1，pH＝7.4的Tris-HCl緩沖溶液1 mL用水稀釋至刻度并搖勻，放置25 min。分別在291K、301K、311K溫度下，掃描熒光猝滅光譜和同步熒光光譜（Δλ＝15 nm和60 nm），記錄F0和F（F和F0分別指CE存在與不存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度）。其最大激發(fā)波長(zhǎng)（λex）和最大發(fā)射波長(zhǎng)（λem）位于280 nm／340nm處。以相應(yīng)的CE溶液作為參比，記錄CE-BSA體系的吸收光譜。

2　結(jié)果與討論

2．1反應(yīng)條件的優(yōu)化 分別考察了緩沖溶液種類、用量、pH值、BSA的濃度、試劑加入順序和反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，選用0.01 mol·L－1，pH＝7.40的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL維持體系酸堿度，1.0×10－6mol ·L－1BSA作為反應(yīng)濃度，BSA→CE→NaCl→Tris-HCl的加入順序，放置25 min后進(jìn)行測(cè)量時(shí)效果最佳。

2．2熒光猝滅光譜 在實(shí)驗(yàn)條件下，CE在測(cè)量波段沒(méi)有熒光，而B(niǎo)SA的熒光較強(qiáng)，并在λex／λem＝280／340nm處，當(dāng)CE加入到BSA之后，雖然λex／λem幾乎未發(fā)生變化，但是其熒光強(qiáng)度明顯隨著CE濃度的增加而逐漸減弱，表明CE能猝滅BSA的熒光，CE與BSA之間存在著相互作用。

2．3猝滅機(jī)制的探討 猝滅過(guò)程遵循S-V方程：F0／F＝1＋Ksv［C］＝1＋Kqτ0［C］，式中Ksv為猝滅常數(shù)；Kq為速率常數(shù)（動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)最大值約為2×1010L·mol－1·s－1）［1－2］；τ0為熒光體平均壽命，一般為10－8s數(shù)量級(jí)［1－2］；［C］為CE濃度。按照實(shí)驗(yàn)方法在291K、301K、311K時(shí)以F0／F對(duì)［C］作圖。根據(jù)Kq＝Ksv／τ0可求出不同溫度下的Kq值，結(jié)果列于Tab 1中。表中Kq值比動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常數(shù)大兩個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明CE對(duì)BSA的猝滅不屬于動(dòng)態(tài)猝滅。隨著溫度升高，直線斜率即Ksv減小，正好與靜態(tài)猝滅機(jī)制相吻合。

若CE對(duì)BSA為靜態(tài)猝滅，應(yīng)符合L-B方程［1－2］：（F0－F）－1＝F0－1＋（KLBF0［C］）－1，式中KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)。（F0－F）－1－［C］－1作不同溫度下的L-B曲線，計(jì)算KLB值列于Tab 1中，表中3個(gè)溫度下的KLB值都在103數(shù)量級(jí)以上，表明CE與BSA由于發(fā)生靜態(tài)猝滅而結(jié)合力較強(qiáng)。隨著溫度的升高，KLB也逐漸下降，這與因靜態(tài)猝滅方式而形成的復(fù)合物隨溫度升高，而越不穩(wěn)定的作用機(jī)制正好相符合。

紫外吸收光譜也是一種區(qū)分猝滅機(jī)制的重要方法［1－2］，實(shí)驗(yàn)表明，CE的加入使BSA中苯環(huán)上的π-π*躍遷引起的特征吸收峰從278 nm紅移到290 nm，吸收強(qiáng)度也隨CE濃度的加大而明顯增加。CE的加入引起B(yǎng)SA紫外吸收光譜的變化這一現(xiàn)象，說(shuō)明CE與BSA間發(fā)生反應(yīng)，有新物質(zhì)生成，更進(jìn)一步證明兩者之間的相互作用機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制。

2．4結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn) 如藥物小分子與BSA大分子存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，它們相互作用的關(guān)系符合lg［（F0－F）／F］＝lgKb＋nlg［C］公式［1－2］。分別在291K、301K、311K溫度下，以lg（F0－F）／F對(duì)lg［C］作圖，由直線的斜率和截距可求出CE與BSA不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，見(jiàn)Tab 1。由Tab 1可知，Kb和n都隨溫度增加而降低，這與因復(fù)合物穩(wěn)定性隨溫度增加而下降的靜態(tài)猝滅機(jī)制是十分吻合的。3個(gè)溫度下的n都約等于1，表明CE與BSA結(jié)合后可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。溫度每升高10K，Kb值減小的程度很小，表明兩者結(jié)合作用對(duì)溫度變化不敏感?？傊?，溫度的提升不利于血清白蛋白攜帶著CE在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配。

2．5熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力類型 根據(jù)熱力學(xué)公式［3］，計(jì)算291K、301K、311K溫度下CE與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH，熵變?chǔ)及吉布斯自由能變?chǔ)，結(jié)果見(jiàn)Tab 2。根據(jù)Ross等［3］總結(jié)出的的規(guī)則判斷，由Tab 2可得，ΔG＜0，表明BSA與CE的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行；ΔH＜0，表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)；ΔS＞0，表明其過(guò)程是熵增加的自發(fā)過(guò)程；ΔH＜0，且ΔS＞0，表明靜電作用力是CE與BSA的主要結(jié)合作用力。

Tab 2 Thermodynamic parameters and value of nHat different temperatures

2．6結(jié)合位置的確定 大多數(shù)藥物在BSA上結(jié)合部位為亞螺旋域ⅡA（含有酪氨酸和色氨酸）和亞螺旋域ⅢA（含有酪氨酸）［4－5］。在波長(zhǎng)280 nm和295 nm激發(fā)下，CE對(duì)BSA的猝滅程度曲線是分開(kāi)獨(dú)立的，沒(méi)有交叉和重疊，說(shuō)明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中，對(duì)比這兩種波長(zhǎng)下的熒光猝滅程度可知，在280 nm激發(fā)時(shí)降低程度更大些，這一現(xiàn)象說(shuō)明在CE與BSA的結(jié)合過(guò)程中，結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域ⅡA。

2．7藥物協(xié)同性 BSA具有多重結(jié)合部位，藥物與BSA結(jié)合時(shí)，BSA各結(jié)合部位之間存在相互影響作用，這種相互影響作用稱為藥物的協(xié)同作用［4－5］，可用Hill方程［4－5］進(jìn)行分析，CE-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)Tab 2。Tab 2表明，3個(gè)溫度下的nH都小于1，表現(xiàn)為負(fù)協(xié)同作用［4－5］，說(shuō)明CE與BSA結(jié)合過(guò)程中，隨著配體CE不斷地結(jié)合到位點(diǎn)，使得后繼配體對(duì)BSA的親和性減弱，即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后，對(duì)后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合起到阻礙作用。隨著溫度的變化，雖然nH變化不大，但也隨溫度升高而增加，說(shuō)明溫度的提升對(duì)CE藥物小分子之間的協(xié)同作用有利。

2．8頭孢克肟對(duì)BSA構(gòu)象的影響 在Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm條件下測(cè)CE加入BSA之后的同步熒光光譜，隨CE濃度的增大，酪氨酸和色氨基酸殘基的λmax幾乎沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)，說(shuō)明CE的加入不改變了BSA的構(gòu)象［2］。

3　結(jié)論

用熒光和紫外光譜法推斷CE對(duì)BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，CE和BSA之間的作用力類型主要為靜電作用力。測(cè)得291K、301K、311K的Kb、n和nH。CE與BSA可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，表明CE可被BSA運(yùn)輸。nH＜1，表明CE對(duì)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)協(xié)同作用，即CE加入使BSA的親和性減弱，不利于后續(xù)CE與BSA的結(jié)合。結(jié)合部位在BSA的亞螺旋域ⅡA中。同步熒光光譜表明CE幾乎不對(duì)BSA構(gòu)象產(chǎn)生影響。該研究結(jié)果為了解CE在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過(guò)程、毒性機(jī)制提供了重要信息。

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中國(guó)圖書分類號(hào)：R341．21；R977．6；R 978．11

關(guān)鍵詞：頭孢克肟；熒光猝滅；相互作用；牛血清白蛋白；結(jié)合部位；協(xié)同作用

Key words：cefixime；fluorescence quenching；interaction；BSA；binding site；cooperative effect

作者簡(jiǎn)介：劉 里（1982－），女，碩士，講師，研究方向：藥物化學(xué)和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用，E-mail：m18908746298＠163．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 21261019）；云南省教育廳科研項(xiàng)目（No 2012Y414）

收稿日期：2015－05－14，修回日期：2015－06－11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1183－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．032