陳一 陳新 鐘科 孫勇 廖麗斐

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院口腔科，四川 南充 637000;2.成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院，四川 成都 610083;3.兵器工業(yè)521醫(yī)院口腔科，陜西 西安 71000)

健康種植體周圍齦下微生物多樣性研究*

陳一1陳新2鐘科2孫勇2廖麗斐3

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院口腔科，四川 南充 637000;2.成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院，四川 成都 610083;3.兵器工業(yè)521醫(yī)院口腔科，陜西 西安 71000)

目的 研究正常種植體周圍齦下微生物群落的多樣性，為牙種植術(shù)后進(jìn)行臨床維護(hù)與干預(yù)提供微生物學(xué)依據(jù)。方法 采用PCR-DGGE技術(shù)初步對收集到的種植術(shù)后3個月正常種植體周圍齦溝液及鄰近天然牙齦溝液中的微生物群落進(jìn)行多樣性分析，成像后切取34條優(yōu)勢條帶，將克隆測序獲得的16SrDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析。結(jié)果 克隆結(jié)果顯示所檢測到的微生物群落可分為17個不同的種屬，其中包括有厭氧菌、需氧菌、真菌等，同時發(fā)現(xiàn)有牙周可疑致病菌的存在。結(jié)論 種植體植入口腔這一復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中，各微生物群落在各時期均維持一定的動態(tài)平衡能防止種植體周圍炎的發(fā)生。

種植體; PCR-DGGE; 微生物群落; 多樣性分析

口腔微生物群落較為復(fù)雜，約有700余種。而種植體植入口腔這樣一個有菌的環(huán)境，并要在這一環(huán)境中行使功能，就要保證種植體周圍微生物群落的動態(tài)平衡。有研究表明[1～3]種植體周可疑致病菌主要為中間普氏菌、伴放線桿菌、福賽擬桿菌聚核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌和螺旋體；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[4]成功種植體周與正常牙周有著相似的微生物群落，如鏈球菌屬、放線桿菌屬、韋容球菌屬、梭桿菌等。回顧文獻(xiàn)，多數(shù)研究致力于研究種植體周圍齦下微生物群落組成，而正常種植體周圍齦下微生物群落多樣性及動態(tài)變化模式方面的研究較少。本文旨在應(yīng)用分子生物學(xué)的方法來研究正常種植體周圍齦下微生物群落的組成及其動態(tài)變化模式，完善牙種植體周圍微生物多樣性的信息，為提高種植修復(fù)的成功率及預(yù)防種植體周圍炎的發(fā)生提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2012年2月成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科接受BEGO系統(tǒng)兩段式種植體義齒修復(fù)的患者11例，其中男性8例，女性3例，年齡(50.8±9.5)。

1.2 方法

1.2.1 種植體周及天然牙周齦溝液的采集 整個操作過程由同一位口腔醫(yī)師進(jìn)行培訓(xùn)后完成。分別采集種植體穿齦部分暴露于口腔3個月時的齦溝液作為實驗組，種植體鄰近的健康臨牙的齦溝液作為對照組。

采用前請患者用清水漱口，刮除取樣牙頸部附著的牙石、菌斑。棉球隔濕，輕輕吹干待測牙的頰面及頸部，以20g左右的力量將2×8mm的Whatman I號無菌濾紙條前端輕輕插入樣本種植體近頰點齦溝內(nèi)，遇到輕微阻力時停止，放置40s后取出濾紙條，迅速放入消毒好的EP管中。間隔1min后，再用新的濾紙條重復(fù)上述操作，多次采集齦溝液以提高樣本中的DNA總量(舍棄沾有血漬和被唾液污染的樣本)。種植牙位鄰牙的齦溝液的采集方法與前者一致，采集完畢后稱重，計算得出齦溝液重量，做好標(biāo)記，放入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 齦溝液樣本DNA的提取、16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增 采用上?？档仙锕镜腄P316-微量樣品基因組DNA提取試劑盒按操作說明提取齦溝液內(nèi)總DNA，隨后，使用Bio-Rad iCycle PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及圖譜分析 將樣本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物采用美國Bio-Rad Dcode sytem進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。紫外光呈像，將DGGE凝膠中的優(yōu)勢條帶切割分離、純化、克隆，再進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆交于上海華大基因公司克隆測序，并將所測定的16SrDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而對齦下優(yōu)勢微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

測序結(jié)果顯示切割分離DGGE凝膠，共得到優(yōu)勢條帶34條，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對后可按其種屬分為17組，其中包括原核類微生物(各種口腔常見細(xì)菌、密螺旋體)、真核類生物(真菌類)以及一些未獲培養(yǎng)的菌屬。

原核類微生物：牙齦卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬、月牙形單胞菌屬、巴斯德氏菌屬、消化鏈球菌屬、密螺旋體菌屬、纖毛菌屬、梭菌屬、噬二氧化碳細(xì)胞菌屬、棒桿菌屬、口腔古細(xì)菌；真核生物：真菌類；以及其他未獲培養(yǎng)的菌屬。各條帶對應(yīng)種屬如圖1所示。

圖1 各條帶對應(yīng)種屬圖

Figure 1 Different genus

3 討論

分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展為微生物多樣性研究提供了新的手段， DGGE技術(shù)利用序列不同的DNA在凝膠中解鏈條件不同的原理，進(jìn)行DNA樣本的擴(kuò)增和電泳分離，獲取的凝膠圖譜即可反映樣品微生物的多樣性、豐富度等特征。該技術(shù)已逐漸應(yīng)用于多種口腔疾病的微生物研究，如牙髓炎、牙周炎、齲病等[5～7]。

本實驗結(jié)果表明，健康種植體及鄰近健康天然牙周圍齦下群落相似，主要由月牙形單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、韋容球菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬等厭氧菌屬組成，進(jìn)一步證實了種植體齦溝液內(nèi)細(xì)菌來源于天然牙周"細(xì)菌庫"這一說法，兩者之間會互相影響互相遷移[8]。

種植術(shù)后3個月內(nèi)均可檢測到有牙齦卟啉單胞菌屬、密螺旋體、口腔古細(xì)菌、梭菌屬等牙周可疑致病菌的存在。牙齦卟啉單胞菌作為牙周病的主要致病菌已被證實[9]，本實驗中健康種植體及天然牙周齦下微生物群落中均可檢測到牙齦卟啉單胞菌，但并未導(dǎo)致種植體周圍炎及牙周炎的發(fā)生,故本實驗支持牙齦卟啉單胞菌為內(nèi)源性條件致病菌。 本實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，口腔古細(xì)菌在健康種植體及健康鄰牙的齦下菌群中也廣泛存在。在牙周病患者的牙周袋、牙髓病根尖周炎性組織和健康人群的齦袋中發(fā)現(xiàn)了口腔古細(xì)菌的存在，其是否參與感染的發(fā)生及其致病性有待進(jìn)一步研究證實[10]。

4 結(jié)論

種植義齒的健康狀況與其齦下微生物群落具有直接關(guān)系，維持種植體周圍微生物群落的動態(tài)平衡是維持種植體成功的重要條件之一，這一動態(tài)平衡的破環(huán)是導(dǎo)致種植體周圍炎的始動因子。在種植術(shù)后3個月種植體周及正常天然牙周均有牙齦卟啉單胞菌、口腔古細(xì)菌等口腔條件致病菌的存在，應(yīng)在維護(hù)種植體周健康的同時加強(qiáng)對口腔天然牙周的維護(hù)，從而為種植體穿齦結(jié)構(gòu)與周圍軟組織的結(jié)合提供穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境。

[1]Van Winkelhoff AJ, Loose BG, Vander Reijden WA,etal. Porphyromonas gingival, Bacteroides forsythus and other putative periodontal pathogens in subjects with and without periodontal destruction[J]. Periodonto1, 2009, 29(11):1023-1028.

[2]Mombelli A, Microbiology and antimicrobial therapy of per-implants[J]. Periodontol, 2002, 28:177-180.

[3]Quirynen M, De Soete M, van Steenberghe D. Infectious risks for oral implants：a review of the literature[J].Clin Oral Implants Res, 2002．13(1)：1-19.

[4]王鈺, 焦艷軍. 人工種植牙齦溝內(nèi)細(xì)菌的研究[J]. 中國口腔種植學(xué)雜志, 2007, 12(4):161-164.

[5]Zijinge V，Harmsen HJ，Kleinfelder JW，etal．Denaturing gradient gel electrophoresis analysis to study bacterial community strutture in pockets of periodontitis patients[J]．Oral Microbial Immunology,2003，8(1)：59-65.

[6]Li Y, Ku CY, Xu J,etal. Survey of oral microbial diversity using PCR based denaturing gradient gel electrophoresis [J]. Dent Res,2005, 84(1):559-564.

[7]Ruth GL, Peter G, Sharon A,etal. Molecular analysis of the sub gingival micro biota in health and disease [J]. Apple environ Microbial, 2007, Jan: 516-523.

[8]QUIRYNEN M, De SOETE M, Van STEENBERCHE D. Infectious risks for oral implants: a review of the literature[J].Clin Oral Implants Res,2002,13(1):1-19.

[9]Bong-Kyu Choi, Seong-Hee Park, Yun Jung Yoo,etal. Detection of major putative. Periodontopathogens in Korean advanced adult periodontitis patients using a nucleic acid-based approach [J]. Periodontol 2000;71: 1387-1394.

[10] 張慧翼,萬呼春. 古菌與牙周病的關(guān)系[J]. 國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008,4(35):134-136.

Microbial diversity research of the health implant under the gum

CHEN Yi1,CHEN Xin2,ZHONG Ke2,etal

(1.DepartmentofStomatology,TheCentralHospitalofNanchong,Nanchong637000,Sichuan,China；2.ChengduMilitaryDistrictAdministrationHospital,Chengdu610083,China; 3.DepartmentofStomatology,521HospitalofWeaponsIndustry,Xian710000,China)

Objective To detect the diversity of the microflora from normal implants gingival crevicular fluid, and provide a reference for the clinical maintenances and interventions after the dental implant surgery. Methods The gingival crevicular fluid in the normal implants and the nearly health tooth at 3months after the dental implant were selected. Diversity were analyzed with PCR-DGGE. 34 Advantage bandings were put to cloning and sequencing. Then submit the determination of 16 SrDNA sequence to the GenBank database and had a similarity comparison analysis consequence. Results The detected microbial community from the cloning result could be divided into 17 different species, including anaerobic bacteria, aerobic bacteria, fungi, etc. The existence of periodontal suspicious pathogenic bacteria was found at the same time. Conclusion When the implants implanted to the oral, which have a complex micro ecological environment, in order to prevent the occurrence of inflammation around the implant, the microbial community in different periods are maintained certain dynamic balance.

Implant; PCR-DGGE; Microbial community; Diversity analysis)

成都軍區(qū)“十一五”面上B類課題(MB09039)

鐘科，Tel:13808008012

R 782.12

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.026

2014-07-10； 編輯： 張文秀)