艾娜 謝席勝 王強 龍瓊先 王彥江 夏夢迪

(1.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 南充 637000；2.瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院 病理科，四川 南充 637000)

腎缺血再灌注損傷大鼠模型足細胞損傷及機制研究*

艾娜1，2謝席勝1王強3龍瓊先4王彥江1夏夢迪1，2

(1.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 南充 637000；2.瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院 病理科，四川 南充 637000)

目的 探討腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，IRI)大鼠模型足細胞的損傷，并對其損傷機制進行初步研究。方法 雄性SD大鼠42只，隨機分為正常組(n=5)、假手術組(n=5)和模型組(n=32)，模型組下設IRI后1h、6h、12h、24h 4個時間點，每個時間點8只大鼠。通過阻斷大鼠雙側腎臟血流構建腎IRI模型。采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠的腎功能，流式細胞儀檢測血活性氧(reactive oxygen species, ROS)的變化，糖原染色(periodic Acid Schiff, PAS)了解腎臟病理損害，通過透射電鏡觀察足細胞損傷情況。結果 在IRI大鼠模型中，我們發(fā)現(xiàn)了明顯的足細胞損傷現(xiàn)象，即足細胞減少，足突消失，基底膜增厚。同時觀察到，隨著缺血再灌注后時間的延長，大鼠肌酐、尿素氮水平逐漸升高，紅細胞中ROS熒光強度陽性率逐漸升高，腎小管出現(xiàn)不同程度的管腔擴張、變性與壞死，間質(zhì)炎性細胞浸潤、充血水腫等。相關性分析發(fā)現(xiàn)，紅細胞ROS熒光強度陽性率與腎小管損傷評分、肌酐、尿素氮水平成正相關，與足細胞計數(shù)呈負相關。結論 腎IRI早期足細胞就可出現(xiàn)明顯的損傷，同時伴有血ROS熒光強度陽性率明顯上升；血ROS的變化可能參與了腎IRI足細胞損傷及病理損害的過程。

腎缺血再灌注損傷； 活性氧； 足細胞損傷

腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，IRI)誘導的急性腎功能衰竭是臨床常見疾病，其發(fā)病率高，但臨床治療效果差。既往研究多關注腎IRI引起急性腎小管壞死機制，而腎IRI是否引起腎小球病變的研究報道甚少。本實驗擬通過構建腎IRI大鼠模型，觀察腎IRI大鼠腎小球足細胞的變化，以及通過流式細胞儀檢測大鼠血活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化，了解IRI大鼠模型足細胞的損傷情況，并對其損傷機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠42只，6～8周齡，體重(220～250)g，購自川北醫(yī)學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2008- 1B。尿素(BUN)檢測試劑盒、肌酐(Cr)檢測試劑盒(上?？迫A生物公司)；活性氧檢測試劑盒(碧云天生物研究所)。HITACHI全自動生化分析儀(日立公司)；KDC-40低速離心機(科大創(chuàng)新公司)；FAsccaliber流式細胞儀(BD公司)；日立H-600IV型透射電鏡(日立公司)。

1.2 動物分組及造模 雄性SD大鼠42只，隨機分為正常組(n=5)、假手術組(n=5)和模型組(n=32)，模型組下設IRI后1h、6h、12h、24h，4個時間點(n=8)。實驗組：3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)注射麻醉后[1]，沿腹正中線切口，逐層分離暴露雙側腎臟，游離出雙側腎動脈，將消毒的壓脈帶片段包裹在腎動脈外層，將手術線系在壓脈帶片段外迅速打結，使腎缺血45min后再灌注。假手術組除不阻斷雙側腎臟血流，其余處理與實驗組相同。

手術前后情況觀察：術中阻斷雙側腎動脈后，可見腎臟由鮮紅變紫黑色，去結扎線后，恢復血流灌注，可見腎臟迅速由紫黑色變?yōu)轷r紅；術后1～3h，可見大鼠蘇醒，逐漸恢復活動，視為造模成功。腎臟恢復血流后5 min，腎臟未恢復正常顏色；或術中大出血；或術后1～3 h，大鼠未蘇醒或死亡，視為造模不成功。

1.3 指標檢測

1.3.1 Scr和BUN檢測 處死大鼠前心臟采血3ml，按4200 r/min 5min離心后保存于-20℃冰箱，待標本收集完后統(tǒng)一檢測。

1.3.2 流式細胞儀檢測血ROS的變化 紅細胞洗滌：將收集的血液用0.9%的生理鹽水反復漂洗，離心(3800r/min 5min)，直至離心后漂洗液清亮為止，去除上清液備用。

實驗組：取DCFH-DA 1μl，用無血清培養(yǎng)液按照1∶1000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmmol/L。向DCFH-DA稀釋液中加入1μl已洗滌好的紅細胞，放入流式細胞儀專用暗盒，在37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，每3-5min混勻一次，使探針和細胞充分接觸。孵育結束后，離心去除上清液，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞三次，充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，最后加入3ml無血清培養(yǎng)液，放到流式細胞儀進行檢測。對照組：在DCFH-DA稀釋液中加入活性氧陽性對照試劑(Rosup 1μl)，其余操作同實驗組。依據(jù)各組大鼠紅細胞ROS熒光強度陽性率進行統(tǒng)計。

1.3.3 腎臟PAS染色 將雙側腎臟取下后沿縱軸剖開，用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)切片，PAS染色，光鏡下觀察。根據(jù)腎小管壞死程度，參考文獻[2]的半定量病理評估法評分：評分越高說明腎小管壞死越嚴重(最高4分)，0分：正常腎臟；1分：最輕微的(<25%的腎小管受累)；2分：輕度壞死(25%～50%的腎小管受累)；3分：中度壞死(50%～75%的腎小管受累)；4分：重度壞死(>75%的腎小管受累)。選擇兩個不同的區(qū)域，在400倍光鏡下分別選擇10個不同的視野進行評分。

1.3.4 腎組織超微結構及足細胞的電鏡觀察：取部分腎組織經(jīng)3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，1μm半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察亞細胞結構的病理改變以及腎微血管超微結構的改變。每只大鼠腎組織在10000×放大倍數(shù)下取30個視野，以確保每只大鼠最少觀察100個足細胞，應用計算機圖像分析軟件計數(shù)足細胞數(shù)目，以及腎小球基底膜的厚度。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 正常組大鼠活動自如，飲食飲水正常。手術后各組大鼠的蘇醒時間不一，假手術組大約于術后30min蘇醒。模型組大鼠多在術后1h蘇醒。術后，假手術組大鼠精神尚可，偶有進食飲水，模型組大鼠精神欠佳，活動減少。實驗組32只大鼠，造模成功30例，成功率為93.75%。其中12h組1只大鼠于腎動脈結扎后40min死亡；24h組1只大鼠于腎動脈結扎30min后死亡。對其解剖未發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)出血等明顯異常。

2.2 各組尿量記錄 正常組大鼠尿量為(10.08±0.97)ml，假手術組大鼠尿量為(1.94±0.63)ml，IRI各組大鼠均無小便，結果見圖1。

Figure 1 The urine volume of each group

注：與正常對照組相比，*P<0.05

2.3 各組大鼠腎功變化 結果見表1。

表1 各組大鼠的腎功檢測情況

注：肌酐 與正常組相比：①P<0.05；與假手術相比：②P<0.05 尿素氮 與正常組相比：①P<0.05，②P>0.05；與假手術相比：①P<0.05,②P>0.05

2.4 各組大鼠紅細胞ROS檢測 結果見表2，圖2。

表2 各組大鼠紅細胞ROS熒光強度陽性率檢測情況

注：與正常組相比：①P<0.05，與假手術相比：②P>0.05。

2.5 各組大鼠病理改變

2.5.1 外觀 假手術組為正常腎組織表現(xiàn)；IRI組肉眼可見腎皮質(zhì)，腎髓質(zhì)瘀血、色深暗。

2.5.2 PAS染色 IRI組腎小管上皮細胞腫脹，界限不清，出現(xiàn)不同程度的變性與壞死，間質(zhì)炎性細胞浸潤，充血水腫。結果見圖3、圖4。

2.5.3 電鏡檢查結果 正常組大鼠腎小球上皮細胞及突足，內(nèi)皮細胞完好，血管開放良好，系膜基質(zhì)及系膜細胞結構清晰。IRI組大鼠腎小球出現(xiàn)內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)聚集，核固縮，壞死。上皮細胞增生微絨毛樣變，突足消失，系膜基質(zhì)增生嚴重，結果見表3，圖5。

圖2 缺血再灌注大鼠紅細胞活性氧陽性率檢測Figure 2 Ischemia-reperfusion in rat erythrocytes reactive oxygen positive rate

①:正常對照組 ②:假手術組 ③:IRI 1h組 ④:IRI 6h組 ⑤:IRI 12h組 ⑥:IRI 24h組

圖3 各組大鼠腎小管損傷評分

注：與正常對照組相比，①P<0.05，各IRI組間比較P>0.05

2.6 相關性分析 紅細胞ROS熒光強度陽性率與肌酐呈正相關(r=0.706，P<0.01)；與尿素氮呈正相關(r=0.648，P<0.01)，與腎小管損傷評分呈正相關(r=0.752，P<0.01)，與足細胞計數(shù)呈負相關(r=-0.875，P<0.01)。足細胞計數(shù)與肌酐呈負相關(r=-0.651，P<0.01)；足細胞計數(shù)與尿素氮呈負相關(r=-0.580，P<0.01)；與腎小管損傷評分呈負相關(r=-0.635，P<0.01),結果見圖6。

圖4 缺血再灌注大鼠腎小管組織學改變(PAS×200)

Figure 4 The renal tubular tissue changes of ischemia-reperfusion rat(PAS×200)

①:正常對照組 ②:假手術組 ③:IRI 1h組 ④:IRI 6h組 ⑤:IRI 12h組 ⑥:IRI 24h組

圖5 各組大鼠腎臟電鏡圖片(×10000)

Figure 5 Electron microscopy images of rats of all groups(×10000)

①:正常對照組 ②:假手術組 ③:IRI 1h組 ④:IRI 6h組 ⑤:IRI 12h組 ⑥:IRI 24h組

3 討論

本研究通過阻斷雙側腎臟血流建立腎IRI動物模型，動態(tài)觀察了大鼠足細胞損傷變化及腎功能腎臟病理的改變。

研究結果顯示在腎IRI術后，大鼠血肌酐、尿素氮水平持續(xù)升高，說明腎缺血再灌注對腎臟造成了損傷，表明我們的造模方法成功構建了腎IRI大鼠模型，這與既往關于IRI大鼠模型的研究結果一致[3]。通過PAS染色發(fā)現(xiàn)，腎IRI各組大鼠腎小管上皮細胞腫脹，界限不清，出現(xiàn)不同程度的變性與壞死，間質(zhì)炎性細胞浸潤，充血水腫，并且隨著缺血后再灌注時間的延長呈逐漸加重趨勢，至IRI 24h時出現(xiàn)腎小管大片狀壞死，腎小管結構紊亂。說明腎IRI后引起腎小管損傷，出現(xiàn)腎功能的異常，這與既往研究結果一致[4]。

我們之前的研究已經(jīng)證實在腎IRI早期，血紅細胞ROS熒光強度陽性率的升高也能很好的反應腎組織和全身氧化應激的狀態(tài)[5]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，在缺血再灌注損傷早期，血紅細胞ROS熒光強度陽性率已明顯升高，且隨著缺血后再灌注損傷時間的延長呈逐漸升高趨勢。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，血紅細胞ROS熒光強度陽性率與腎小管損傷評分、肌酐、尿素氮均呈正相關。進一步證實ROS的產(chǎn)生增多與IRI的病理損害和腎功能的改變密切相關，這與既往研究一致[6]。

我們的研究不僅發(fā)現(xiàn)腎IRI大鼠腎小管上皮細胞的損傷嚴重，還發(fā)現(xiàn)在腎IRI早期，大鼠腎小球足細胞即出現(xiàn)嚴重的損傷，呈現(xiàn)足細胞突足消失，系膜基質(zhì)增生嚴重。而既往關于腎IRI模型腎小球足細胞的變化的研究結果存在較大分歧。李俊[7]等通過切除大鼠右腎，夾閉左腎動脈45分鐘構建腎IRI模型，觀察再灌注后6小時、12小時、24小時、72小時后，發(fā)現(xiàn)腎IRI大鼠腎小球結構變化不明顯。Andersson等[8]通

圖6 相關性分析結果

Figure 6 The correlation analysis

注：紅細胞ROS熒光強度陽性率與①肌酐、②尿素氮、③腎小管損傷評分呈正相關，與④足細胞計數(shù)呈負相關；足細胞計數(shù)與⑤肌酐、⑥尿素氮、⑦腎小管損傷評分呈負相關。

過阻斷腎臟血流15分鐘，發(fā)現(xiàn)輕度腎IRI后足細胞和基底膜沒有重大變化。而王新良[9]等通過離斷右側腎動脈，夾閉左側腎動脈45分組構建腎IRI模型，再灌注后持續(xù)觀察5小時，發(fā)現(xiàn)腎小球足細胞足突排列紊亂，有明顯的融合現(xiàn)象，與我們的研究結果一致。我們推測腎IRI大鼠出現(xiàn)嚴重的足細胞損傷，可能與腎缺血及再灌注時間的長短，以及與腎IRI模型制作的手術方式等有關。關于腎IRI腎小球足細胞損傷的機制，相關研究報道較少。我們通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，足細胞計數(shù)與血ROS熒光強度陽性率呈負相關，在腎IRI早期血紅細胞ROS熒光強度陽性率明顯升高，與此同時腎小球足細胞即出現(xiàn)明顯的損傷，因此我們推測血紅細胞ROS的變化與腎小球足細胞的損傷密切相關，但是血紅細胞ROS具體通過何種機制引起足細胞損傷還需進一步研究。

4 結論

本研究結果顯示，腎IRI早期足細胞即出現(xiàn)明顯的損傷，同時伴有血ROS熒光強度陽性率明顯上升；血ROS的變化可能參與了腎IRI足細胞損傷及病理損害的過程。

[1] Zahmatkesh M, Kadkhodaee M, Moosavi SM,etal. Beneficial effects of MnTBAP, a broad-spectrum reactive species scavenger, in rat renal ischemia/reperfusion injury[J]. Clin Exp Nephrol, 2005, 9(3):212-218.

[2] Zaouali MA, Ben Abdennebi H, Padrissa-Altes S,etal. Pharmacolo-Gical strategies against cold ischemia reperfusion injury[J]. Expert Opin Pharmacother, 2010,11(4):537-555.

[3] Sagiroglu T, Sezer A, Torun N,etal. Protective effect of everolimus on renal ischemia reperfusion injury in rats[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2014, 25(2):294-302.

[4] Jung HS, Joo JD, Kim DW,etal. Effect of milrinone on the inflammatory response and NF-kB activation in renal ischemia- reperfusion injury in mice[J].Korean J Anesthesiol, 2014, 66(2):136-142.

[5] 艾娜, 謝席勝, 樊均明, 等. 大鼠血紅細胞活性氧在腎缺血再灌注損傷中的表達及作用研究[J]. 西部醫(yī)學,2013,25(2):164-168.

[6] Devarajan P.Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury[J].J Am Soc Nephrol, 2006,17(6):1503-1520.

[7] 李俊. TRAIL信號通路在大鼠腎缺血再灌注損傷中介導細胞凋亡及米諾環(huán)素干預作用的研究[J].重慶醫(yī)科大學學報,2007,04(1):1-55.

[8] Andersson M, Nilsson U, Hjalmarsson C,etal. Mild renal ischemia- reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier[J]. Am J Physiol Renal Physiol， 2007, 292(6):1802-1809.

[9] 王新良, 王新穎, 牟兆新, 等.腎缺血再灌注對大鼠腎小球超微結構及負電荷位點的影響[J]. 河北醫(yī)科大學學報, 2005,26(5):321-323，358.

Mechanism of podocyte injury of renal ischemia-reperfusion injury in rats

AI Na1,2, XIE Xi-sheng1, WANG Qiang3,etal

(1.DepartmentofNephrology,NanchongCentralHospital,Nanchong637001,Sichuan;2.LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,Sichuan;3.Clinicallaboratory,TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637001,Sichuan;4.DepartmentofPathology,NanchongCentralHospital,Nanchong637001,Sichuan)

Objective To investigate the changes of podocytes and its mechanism in the rat of renal ischemia-reperfusion injury (IRI).Methods 42 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group(n=5), sham group(n=5) and IRI roup(n=32). IRI group is divided into four time points：1 hour, 6 hour, 12 hour and 24 hour. Each time point contained 8 animals. Through blocking bilateral renal blood flow in rats, the IRI model was established. The renal function, the ROS of erythrocyte, the renal pathological damage and podocyte injury were observed. Results We found the obvious podocyte damage phenomenon in the IRI rat model, such as decreased podocyte and foot processes and thick basement. The level of creatinine and blood urea nitrogen (BUN) and the positive rate of ROS fluorescence intensity in erythrocyte were gradually increased with the extension of the time after ischemia-reperfusion injury rats. Tubular could appearing vary degrees of luminal expansion and degeneration and necrosis and interstitial inflammatory cell infiltration and congestion and edema and so on. Correlation analysis found that the positive rate of erythrocyte ROS fluorescence intensity was positively correlated with tubular injury score, creatinine and blood urea nitrogen leve, but negatively correlated with podocyte count. Conclusion The damage of podocytes obvious in the early of IRI, at the same time the blood of ROS is significantly increased. The change of blood ROS may be involved in the process of renal IRI podocyte injury.

Renal ischemia-reperfusion injury; Reactive oxygen species; Podocyte injury

；四川省教育廳科研項目(10ZC027)

謝席勝，E-mail：xishengx@163.com

R 692.3+9

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.004

2014-07-11； 編輯： 張文秀)