黃學(xué)平 鄭捍東 葉維霞 吳文友

(瀘州市人民醫(yī)院 1.神經(jīng)外科, 2.消化內(nèi)科， 四川 瀘州 646000)

體外培養(yǎng)SD大鼠神經(jīng)干細胞多向分化的實驗研究*

黃學(xué)平1鄭捍東1葉維霞2吳文友1

(瀘州市人民醫(yī)院 1.神經(jīng)外科, 2.消化內(nèi)科， 四川 瀘州 646000)

目的 分離培養(yǎng)SD大鼠神經(jīng)干細胞( NSCs)，誘導(dǎo)分化，為神經(jīng)干細胞的分化研究提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。方法 分離新生24小時內(nèi)SD大鼠端腦及中腦，采用無血清培養(yǎng)技術(shù)進行NSCs體外擴增培養(yǎng)及傳代。對NSCs及其分化后的細胞進行nestin、GFAP、NF 200免疫細胞化學(xué)染色。結(jié)果 分離培養(yǎng)的細胞增殖活性好，6～7天后生長成由上百個細胞組成的大克隆球，nestin呈陽性表達。經(jīng)誘導(dǎo)分化后，克隆球間存在網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，GFAP和NF 200呈陽性表達。結(jié)論 實驗中分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞具有自我更新和增殖能力，并具有向星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元等方向分化的多向分化潛能。

SD大鼠； 神經(jīng)干細胞； 免疫細胞化學(xué)； 多向分化

神經(jīng)干細胞是存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一群具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞，可以分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[1，2]。近年來，神經(jīng)干細胞的研究成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點之一。神經(jīng)干細胞移植被認為是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的方案之一[3]。本研究采用新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠作為供體，分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，通過觀察、檢測神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞分化的生物學(xué)特性，為神經(jīng)干細胞的分化研究提供更多實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24小時內(nèi)清潔2級SD大鼠，購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，D-Hank’s液(Hyclone)，B27神經(jīng)細胞生長添加劑(Gibco)，bFGF、EGF(Peproteeh)，多聚賴氨酸(Sigma)，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。nestin抗體購自Chemicon公司，NF 200和GFAP抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。臺盼藍、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 NSCs的原代分離培養(yǎng) NSCs的分離：取新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠4只，用75%乙醇消毒頭部后，斷頭處死，在超凈臺內(nèi)以眼科剪逐層剪開頭皮及顱骨后，無菌條件下迅速取出端腦及中腦放入預(yù)冷的D-Hank’s 液中，去除腦膜及血管后剪碎，加入0.125%胰酶、0.02% EDTA液4 ml，37℃消化20～30 min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基4 ml終止消化，輕柔吹打至混懸液后，用400目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000 rpm離心5 min，棄去上清，用D-Hank's重復(fù)清洗3遍后，加入完全培養(yǎng)基(含2% B27，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)后，調(diào)整細胞密度為1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后的細胞每2～3 d半量換液，培養(yǎng)6～7 d傳代1次。逐漸去除碎片及其他細胞，分離出NSCs。

1.3.2 NSCs的傳代培養(yǎng) 在原代培養(yǎng)第7天，無菌條件下進行傳代培養(yǎng)。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，用吸管將沉在瓶底而沒有貼壁的神經(jīng)球收集入離心管，棄去貼壁的細胞，1500 rpm離心5min，吸去上清液后，加入NSCs完全培養(yǎng)基，輕柔吹打使神經(jīng)球盡可能分離為單細胞懸液，計數(shù)后仍以1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。此后每2～3 d半量換液，培養(yǎng)6～7 d傳代1次。

1.3.3 NSCs的免疫化學(xué)鑒定 取生長良好的第3代NSCs克隆球，1×105/ml接種至預(yù)先放置多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時，使大部分克隆球貼壁，將蓋玻片取出自然晾干。PBS清洗2次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定30 min后， PBS清洗干凈后以3% H2O2去離子水孵育10 min，清洗3次，再以山羊血清封閉液37℃封閉10 min。滴加一抗nestin(1∶100)，37℃孵育2小時，PBS清洗3次，每次5 min，滴加二抗B液37℃孵育20 min，PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15 min，具體步驟參照SP試劑盒說明書。PBS清洗3次后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。對照染色以PBS代替一抗，余相同。

1.3.4 NSCs的誘導(dǎo)多向分化 取含生長良好的第3代NSCs克隆球的細胞懸液，1500 rpm離心5 min，棄去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12 (1∶1)培養(yǎng)液輕柔吹打為單細胞懸液后，接種于多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內(nèi)，隨時觀察NSCs分化狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，進行GFAP和NF 200的免疫細胞化學(xué)染色，方法步驟同nestin。

2 結(jié)果

2.1 NSCs形態(tài)學(xué)觀察及免疫細胞化學(xué)鑒定 倒置顯微鏡下動態(tài)觀察原代培養(yǎng)NSCs，細胞懸液接種24小時后可見大量單個大小相近的圓形細胞，細胞核大，胞質(zhì)較少，折光性較高；2～3 d半定量換液后可見較多懸浮生長的形態(tài)不一的細胞球，呈桑椹狀，每個細胞球由數(shù)個到數(shù)十個細胞組成，折光性強，無突起生長；6～7 d后，生長成由上百個細胞組成的大克隆球(圖1a)。神經(jīng)細胞克隆球經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色后，神經(jīng)干細胞特異性表達的巢蛋白nestin呈強陽性表達，胞漿呈棕黃色(圖1b)。

圖1 NSCs克隆球形態(tài)及nestin免疫細胞化學(xué)染色

Figure 1 The morphology and nestin immunocytochemistry of neurosphere

注：a.培養(yǎng)6天的神經(jīng)干細胞球，呈桑椹狀(×400)；b. 神經(jīng)干細胞球nestin呈強陽性表達(SP,×200)

2.2 NSCs的誘導(dǎo)分化 將培養(yǎng)第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化，12小時后可見到部分NSCs克隆球緊貼細胞培養(yǎng)瓶，許多偽足樣突起從克隆球中伸出；分化至第3 天時，可見許多單個細胞逐漸從克隆球中遷出，細胞由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)橛型黄鸬募毎?圖2)。培養(yǎng)至第7天時，細胞突起明顯增多，細胞之間形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。

2.3 NSCs誘導(dǎo)多向分化細胞的免疫細胞化學(xué)鑒定 將NSCs培養(yǎng)至第7天時，細胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，采用不同神經(jīng)細胞特異性抗體進行免疫細胞化學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細胞標記抗體GFAP在多角形胞體分化細胞的胞漿中呈陽性表達(圖3a)。此類細胞從胞體伸出許多長的突起，連成網(wǎng)狀。神經(jīng)元標記抗體NF 200在卵圓形胞體分化細胞的胞漿中呈陽性表達(圖3b)。該類細胞發(fā)出突起相對較少，大部分細胞發(fā)出2個細胞突起。

圖2 神經(jīng)干細胞球誘導(dǎo)分化后3天(×400)

Figure 2 Neurosphere differentiation for 3 d (×400)

3 討論

近年來，NSCs已被研究證實廣泛分布于胚胎和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。胚胎腦的端腦、海馬、紋狀體、中腦、室管膜/室管膜下區(qū)、脊髓和成年腦的腦室下區(qū)、紋狀體、海馬顆粒下區(qū)等已成功分離培養(yǎng)出NSCs[2]。NSCs因其具有自我維持、自我更新、可遷徙性、轉(zhuǎn)分化性、低免疫原性、多向分化潛能等生理特性，使其成為基因治療的載體或供體細胞，且可在Ⅳ型膠原的誘導(dǎo)下分化為平滑肌細胞參與神經(jīng)組織血管再生，為臨床上脊髓損傷、帕金森病、周圍神經(jīng)損傷后肌肉萎縮的治療等提供了新的思路和方法[4～7]。

圖3 NSCs誘導(dǎo)分化細胞的GFAP和NF200免疫細胞化學(xué)染色

Figure 3 GFAP and NF200 immunocytochemistry of differentiated cells derived from NSCs

注：a. 分化細胞GFAP陽性 (SP,×400)；b. 分化細胞NF200陽性 (SP,×400)

本研究從新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠的端腦及中腦成功地分離培養(yǎng)了NSCs，NSCs在含有能刺激神經(jīng)干細胞增殖的生長因子B27、bFGF 和EGF無血清培養(yǎng)液中大量增殖，呈懸浮球形生長，并連續(xù)傳代生長，體現(xiàn)NSCs自我維持和自我更新的特性。巢蛋白(nestin)是中間絲蛋白家族的成員，被列為第Ⅵ類中間絲蛋白，該蛋白主要在神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細胞及神經(jīng)前體細胞中表達，可以作為神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞以及胰島前體細胞的特異性標志物[8]。巢蛋白的表達是暫時性的，一旦前體細胞分化成終末分化細胞如神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞，巢蛋白的表達便終止[9,10]。我們的實驗結(jié)果可見，經(jīng)過傳代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞克隆球nestin呈強陽性表達，表明了經(jīng)傳代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞克隆球保持了神經(jīng)干細胞特性。當去除神經(jīng)干細胞增殖的生長因子的作用，NSCs置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，NSCs發(fā)生分化，不僅表現(xiàn)為細胞生長方式發(fā)生改變，由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，而且細胞形態(tài)也發(fā)生了改變，由圓形分化為卵圓形、多角形等多種形態(tài)的有突起細胞。隨著細胞的繼續(xù)分化，細胞突起明顯增多，分化細胞之間形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。成熟星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元分別表達其特異性標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元標記抗體NF 200。我們采用免疫細胞化學(xué)顯示，GFAP和NF200在分化細胞中呈陽性表達，表明神經(jīng)干細胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化后，部分細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，體現(xiàn)了NSCs的多向分化潛能。

4 結(jié)論

通過從新生SD大鼠的腦組織成功分離、培養(yǎng)出NSCs，并且向星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元等方向分化，體現(xiàn)了NSCs自我維持、自我更新和多向分化的基本特征。神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)為后續(xù)神經(jīng)干細胞的分化研究提供了更多的實驗依據(jù)，對細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究具有重要意義。

[1]McKay R.Stem cells in the central nervous system[J].Science,1997,276(5309):66-71.

[2]Irene A,FiIippo C. Rdial glia and neuraI stem cells[J]. Cell Tissue Res,2008,331(1):165-178.

[3]Lendahl U, Zimmerman LB，Mckay RD.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein[J]. Cell, 1990,60(23):585-595.

[4]王崗，彭麗媛，鞏守平，等. MHP36神經(jīng)干細胞體外經(jīng)Ⅳ型膠原誘導(dǎo)向平滑肌細胞分化的研究[J].西部醫(yī)學(xué),2012,24(6):1045-1049.

[5]孟紅旗，全亞萍.神經(jīng)干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(1):175-178.

[6]Gage FH. Mammalian neural stem cell[J].Science,2000,287(5457):1433-1438.

[7]陳嘉利，周繼輝，郎金波.神經(jīng)干細胞在脊髓損傷中的應(yīng)用與進展[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(14):2631-2634.

[8]Parati EA, Bez A, Ponti D,etal. Neural stem cells. Biological features and therapeutic potential in Parkinson's disease[J]. J Neurosurg Sci, 2003,47(1):8-17.

[9]丁繼固,丁文杰，李光.膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與白細胞介素1β體外誘導(dǎo)中腦神經(jīng)干細胞的分化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(27):5033-5036.

[10] 史東梅，周暢，謝佐平.神經(jīng)干細胞有絲分裂過程中nestin表達變化 [J].神經(jīng)解剖雜志,2003,19(2):119-123.

The study on multiple differentiation of neural stem cells isolated from SD rat in vitro

HUANG Xueping1, ZHENG Handong1,YE Weixia2,etal

(1.DepartmentofNeurosurgery,LuzhouPeople'sHospital,Luzhou646000,Sichuan,China; 2.DepartmentofGastroenterology,LuzhouPeople'sHospital,Luzhou646000,Sichuan,China)

Objective To cultivate and induce differentiation of the neural stem cells(NSCs)in vitro, thus providing the experimental evidence for further related research．Methods Tissues of telencephalon and midbrain were isolated from the neonatal SD rat，then the NSCs were cultivated in serum-free culture medium．The immunocytochemistry was applied to detect the expression of nestin, GFAP and NF200 on NSCs and differentiated cells．Results The isolated cells grew well and grew into sphere clones of hundreds of cells after six or seven days, with positive expression of nestin. There were network-like structure between sphere clones, which expressed GFAP and NF200 protein by inducement. Conclusion The isolated and cultivated NSCs have the capacities of self-renew and proliferation, as well as pluripotentiality of differentiate into neurons and astrocytes.

SD rat; Neural stem cell; Immunocytochemistry; Multi-directional differentiation

瀘州市科技計劃項目(2012-S-40)

鄭捍東，主任醫(yī)師，E-mail:704421424@qq.com

R 446.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.06.004

2014-07-10； 編輯： 張文秀)