回神顆粒對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)機(jī)制研究*

摘要：目的：觀察回神顆粒對缺血性卒中腦海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)S100B蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,研究回神顆粒對局灶性腦缺血再灌注損傷影響的可能機(jī)制。方法:取45只Wistar大鼠建立局灶性腦缺血再灌注(I/R)模型,隨機(jī)分成假手術(shù)對照組、腦I/R組、回神顆粒治療組,缺血2h后開始再灌注。免疫組化法檢測缺血不同時(shí)間各組腦海馬缺血中心和周圍區(qū)S100B蛋白,原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測各組腦海馬缺血中心和周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：腦I/R損傷組與假手術(shù)對照組比較，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多(P<0.05), 回神顆粒治療組與腦I/R組相比,凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05);免疫組化檢測結(jié)果顯示, I/R組與假手術(shù)對照組相比, S100B蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05), 回神顆粒治療組與腦I/R組相比, S100B蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：回神顆?？赡芡ㄟ^減少S100B蛋白表達(dá)、抗凋亡對局灶性腦缺血再灌注損傷(I/R)產(chǎn)生保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：回神顆粒；腦缺血；再灌注腦損傷；神經(jīng)細(xì)胞；凋亡

前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，回神顆粒在治療創(chuàng)傷性腦損傷、腦梗塞[1]、腦出血[2]、各種癡呆[3]等神經(jīng)疾病方面都取得了良好的療效。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),回神顆粒對腦缺血再灌注損傷(I/R)具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]。S100B蛋白是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì),是反映神經(jīng)細(xì)胞損傷的標(biāo)記物,目前國內(nèi)外尚無給予回神顆粒治療腦缺血灌注區(qū)S100B蛋白動(dòng)態(tài)觀察的相關(guān)報(bào)道。為進(jìn)一步探討回神顆粒對缺血性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制,本文觀察了大鼠局灶性腦缺血再灌注后給予回神顆粒灌胃后對大鼠海馬區(qū)S100B蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料選用體重200～250g健康雄性Wistar大鼠45只，清潔級(jí)，合格證編號(hào)DK0501-0018，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隔日更換一次飼料及飲水。10%水合氯醛(沈陽試劑廠)，SABC試劑盒，原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒TUNEL(POD)(天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司提供)，DAB顯色劑(武漢博士德); 回神顆粒(天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬武清中醫(yī)醫(yī)院);抗S100B抗體，尼龍線直徑2.3mm(日本伊東公司);BT-100恒流泵(上海滬西分析儀器廠)；全自動(dòng)冰凍切片機(jī)(德國徠卡CM1850)；OLYMPUS HB-2顯微鏡(日本)，計(jì)算機(jī)圖像分析軟件(美國600CL Pixera)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制備及分組缺血模型大鼠參照Zea-Longa線拴法復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO)。大鼠用10%水合氯醛(0.9mL/250g)麻醉，暴露出左側(cè)頸總動(dòng)脈和分叉部，分離動(dòng)脈分叉處的頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，并分別穿線備用。將頸外動(dòng)脈近心端結(jié)扎，將預(yù)先準(zhǔn)備好的直徑為0.235mm、長約5cm、前端加熱成圓形的漁線栓子，用肝素浸泡后從剪口處插入，使?jié)O線栓子經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，向頭端深入至有阻力時(shí)，即阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)入口處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及剪口處，清潔縫合傷口。假手術(shù)對照組除不插入栓子外其余同實(shí)驗(yàn)組。手術(shù)中和手術(shù)后維持動(dòng)物體溫在37℃左右。缺血2h后,拔出栓子2mm,使血液再灌注。45只大鼠隨機(jī)分成I/R模型組、治療組、假手術(shù)組，各組再分成1d、3d、7d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只，分別于缺血后1d、3d、7d取腦組織。

1.2.2缺血各組處理方法均于術(shù)后當(dāng)日起給藥。回神顆粒組給予回神顆粒灌胃。具體做法：用生理鹽水將回神顆粒稀釋成混懸液，按每人每日三次劑量5g×3=15g，則大鼠(體重200～250g)每日劑量為0.018g×15=0.27g，配成3mL灌胃液，每日一次性灌服治療，連續(xù)治療7d；假手術(shù)組和腦缺血模型(I/R)組僅給予3mL0.9%生理鹽水灌服。

1.2.3組織處理按不同缺血時(shí)間斷頭,取腦組織。實(shí)驗(yàn)分3組:假手術(shù)組、 I/R組及回神顆粒治療組,每組15只,均為腦缺血2h再灌注1d、3d、7 d處死,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。

1.2.4免疫組化染色檢查各組大鼠至指定時(shí)間點(diǎn)處死后斷頭取腦,取前囟前后1mm腦組織,常規(guī)固定,石蠟包埋,每隔100μm連續(xù)冠狀切片(厚6μm),進(jìn)行免疫組化染色檢測S100B蛋白的表達(dá)情況。顯微鏡下觀察海馬細(xì)胞胞漿有棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.2.5TUNEL原位凋亡染色法檢測細(xì)胞凋亡按照原位TUNEL試劑盒說明書對各組大鼠腦組織切片進(jìn)行凋亡染色,細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。

2結(jié)果

2.1各組S100B蛋白表達(dá)腦I/R損傷組與假手術(shù)對照組相比, S100B蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01), 回神顆粒治療組較腦I/R組S100B蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05),見表1。

表1不同腦I/R時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬

組別1d3d7dI/R模型組27.4±1.14*26.2±2.387*17.8±1.789*治療組22.4±1.949*#13.4±1.517*#11.2±1.581*#假手術(shù)組7.3±1.0926.9±1.1376.1±0.998

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.2神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況腦I/R組與假手術(shù)對照組比較，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多(P<0.01), 回神顆粒治療組與腦I/R組比較，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(P<0.05),見表2。

　　　個(gè)

注：與模型組比較，*P<0.01，與假手術(shù)組比較，※P<0.05。

3討論

回神顆粒由全國名中醫(yī)專家、博士生導(dǎo)師、享受國務(wù)院特殊津貼專家,全國第三批名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)繼承指導(dǎo)老師,首屆中醫(yī)藥傳承特別貢獻(xiàn)獎(jiǎng)獲得者,中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)老年病分會(huì)副主任委員陳寶貴教授經(jīng)過近50年的臨床及實(shí)驗(yàn)研究研制而成,應(yīng)用于臨床,對高血壓性腦出血急性期、創(chuàng)傷性顱腦損傷等療效顯著,可有效降低致殘率,提高生存質(zhì)量[5]。

回神顆粒主要以鹿角、丹參、菖蒲、靈芝、郁金等藥物組成,該藥補(bǔ)益五臟精氣,兼以化郁、祛痰、消瘀,從而調(diào)整五臟功能,達(dá)到治療目的?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[6]，人參皂苷可以減少鈣沉積;石菖蒲水提醇沉液可以改善腦缺血缺氧狀態(tài)，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力，抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9];丹參酮具有鈣通道拮抗作用，減輕鈣超載;丹參、五味子、川芎嗪均可以對抗氧自由基引起的損傷[7]。該藥的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：回神顆?？蓽p少腦挫傷面積、細(xì)胞損傷、腦水腫程度，甚至還能恢復(fù)認(rèn)知功能，改善空間記憶。作用機(jī)制目前有幾種理論：龐瑩等[4]認(rèn)為，回神顆粒是通過上調(diào)BDNF的表達(dá)，起到控制腦缺血面積以及神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)的作用。趙廷浩等[8]發(fā)現(xiàn)，回神顆粒能改變Bcl/Bax基因表達(dá)的比率,使BclmRNA水平升高,BaxmRNA水平降低,產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡的作用。

本實(shí)驗(yàn)顯示,對腦缺血再灌注損傷的大鼠使用回神顆粒治療后，可以明顯減少凋亡細(xì)胞數(shù)和S100B蛋白表達(dá),說明回神顆粒能明顯減少I/R造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,提示局灶性腦缺血時(shí)給予回神顆粒治療，對神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與減少凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生、S100B蛋白表達(dá)有關(guān)。這可能是回神顆粒治療各種腦損傷疾病、對腦缺血產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制之一。

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(收稿日期：2014-05-27)編輯：萬崇毅

*基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(國中醫(yī)藥人教發(fā)[2011]41號(hào))。

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡介：★劉丹*劉丹(1981—)，女，博士。研究方向：心血管疾病。Tel：15122588780，E-mail：niki19860717@163.com。指導(dǎo)：陳寶貴(天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬武清中醫(yī)醫(yī)院天津 301700)