徐恩賜, 戴科軍, 歐　瑤, 湯　華

(江蘇省常州市腫瘤醫(yī)院 腫瘤放射治療科, 江蘇 常州, 213000)

電離輻射對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ataxin-1基因表達(dá)的影響

徐恩賜, 戴科軍, 歐瑤, 湯華

(江蘇省常州市腫瘤醫(yī)院 腫瘤放射治療科, 江蘇 常州, 213000)

摘要:目的探討電離輻射對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87中Ataxin-1基因表達(dá)的影響。方法采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中A172、U251、U373、U87中Ataxin-1表達(dá)水平的差異，選取U251、U87為研究對(duì)象, 采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)各組Ataxin-1mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果4種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ataxin-1的表達(dá)水平存在明顯差異; U251、U87在不同劑量的X射線照射后24 h，其Ataxin-1蛋白及mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯增加(P<0.05); 不同時(shí)間檢測(cè)提示，在X射線照射后4 h，Ataxin-1蛋白及mRNA的表達(dá)量即開始上升，并持續(xù)到照射后48 h (P<0.05)。結(jié)論Ataxin-1在不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)水平存在明顯差異; Ataxin-1基因有可能作為臨床腦膠質(zhì)瘤放療靶基因，對(duì)臨床放療療效的判斷具有一定的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞:Ataxin-1; 腦膠質(zhì)瘤; 影響

Ataxin-1蛋白是Ⅰ型脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA1)的基因編碼產(chǎn)物，主要在神經(jīng)元核內(nèi)表達(dá)，浦肯野氏細(xì)胞胞漿內(nèi)也可以檢測(cè)到，而在外周組織的胞漿中也有著廣泛的表達(dá)[1]。根據(jù)SCA1基因中CAG序列重復(fù)次數(shù)不同，分別表達(dá)野生型及突變型Ataxin-1。突變型的Ataxin-1與神經(jīng)元內(nèi)正常蛋白相互作用并在細(xì)胞核內(nèi)沉積形成核內(nèi)包涵體，產(chǎn)生神經(jīng)損害癥狀[2-3]。大多數(shù)腫瘤相關(guān)蛋白可以與核仁包涵體結(jié)合，并且核仁包涵體已經(jīng)在非神經(jīng)元細(xì)胞中被鑒定出來[4]。聚集體(核仁包涵體與胞漿包涵體均屬于聚集體的一種)的形成不僅與許多疾病密切相關(guān), 如阿爾海默氏癥, 帕金森氏癥等[5]，而且聚集體的形成和破壞與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[6]。Huda Zoghbi等[7]發(fā)現(xiàn)正常的和突變形式的Ataxin-1在SCA1中都具有一定程度上類似的功能，但突變形式更加有效，而在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，正常蛋白的水平過高時(shí)也會(huì)導(dǎo)致一些異常神經(jīng)元功能的產(chǎn)生，不過相關(guān)的機(jī)制尚未明確。在組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)的野生型Ataxin-1也可能通過一些途徑與腫瘤相關(guān)因子作用，繼而產(chǎn)生一些生物效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中A172、U251、U373、U87中Ataxin-1蛋白的表達(dá)水平，并將電離輻射與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株內(nèi)Ataxin-1表達(dá)水平聯(lián)系起來，探討電離輻射對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中Ataxin-1表達(dá)水平的影響，對(duì)進(jìn)一步研究Ataxin-1基因?qū)Ψ派涿舾行缘挠绊懹兄匾笇?dǎo)意義。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251、U373、U87，均由原蘇州大學(xué)長(zhǎng)江學(xué)者實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞收藏中心(ATCC)，由該實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和保藏。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Western blot實(shí)驗(yàn)抗Ataxin-1單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物公司。PCR引物采用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由美國(guó)Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司實(shí)驗(yàn)所需其余試劑均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)分組

X射線對(duì)Ataxin-1表達(dá)水平的影響，按吸收劑量1、3、5和8 Gy，共4個(gè)劑量組，3 Gy組再以照射后4、16、24、28 h分4個(gè)時(shí)間組,上述實(shí)驗(yàn)中均設(shè)立未處理對(duì)照組。

1.3　細(xì)胞培養(yǎng)及照射

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U87、U251、U373培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸及100萬 U/L青霉素和鏈霉素的RPMI 1 640培養(yǎng)基中。細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。細(xì)胞置于直線加速器下，射線性質(zhì)為高能6 MV X射線，照射野為20 cm×20 cm, 源皮距為100 cm，吸收劑量率為2 Gy/min。

1.4　Western blot實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，免疫沉淀裂解液裂解細(xì)胞，離心收集蛋白樣品，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組樣品取50 μg總蛋白采用10% SDS-PAGE分離，以5%脫脂奶粉進(jìn)行非特異性抗原的封閉，加入特異性一抗溶液室溫作用1 h，0.1% 吐溫20 PBS洗滌后與HRP偶聯(lián)的二抗溶液室溫作用1 h，洗滌后采用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行曝光。同一張膜測(cè)定β-肌動(dòng)蛋白作為樣品內(nèi)參。通過quantity one圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度進(jìn)行檢測(cè)，以內(nèi)參β-actin的灰度為標(biāo)準(zhǔn)，各組蛋白的灰度值與之相比。

1.5　RT-PCR法

收集細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用DEPC水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定RNA純度(A260/A280>1.80)。各取總RNA 5 μg，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第1鏈cDNA合成(詳見反轉(zhuǎn)錄試劑盒參考說明)。采用premier primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，Ataxin-1上游引物5′-GGA GGTCCTGAACGGTGAGATGG-3′，下游引物為5′-TTTGGAACACGGCAAATCAAGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為1063 bp。GADPH上游引物為5′-CAACTACATGGTCTACATGTTCC-3′, 下游引物為5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為700 bp。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察、拍照。通過quantity one圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度進(jìn)行檢測(cè)，以內(nèi)參GAPDH的灰度為標(biāo)準(zhǔn)，各組mRNA的灰度值與之相比。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用2個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中Ataxin-1表達(dá)水平的差異

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，收取蛋白，采用Western blot法以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株內(nèi)Ataxin-1蛋白表達(dá)水平。并通過quantity one圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度進(jìn)行檢測(cè)，以各自β-actin條帶的灰度為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組的Ataxin-1條帶灰度值與之的比值。A172腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中Ataxin-1的表達(dá)水平為(0.741±0.043), U87為(0.185±0.012), U251為(0.926±0.164)，U373為(0.185±0.047)。

2.2　不同劑量電離輻射對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ataxin-1表達(dá)水平

選取腦膠質(zhì)瘤中Ataxin-1表達(dá)較高的U251和表達(dá)較低的U87，用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)Ataxin-1蛋白和mRNA在不同劑量的電離輻射照射24 h后表達(dá)水平的變化。照射不同劑量的X射線后Ataxin-1mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，從受照3 Gy開始均明顯增加(P<0.05)。見表1、2。

表1　不同劑量電離輻射照射后Ataxin-1

與0 Gy相比，*P<0.05。

表2　不同劑量電離輻射照射后Ataxin-1 mRNA

與0 Gy相比，*P<0.05。

2.3　電離輻射后不同時(shí)間Ataxin-1表達(dá)水平的變化

用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)電離輻射(3 Gy)照射后不同時(shí)間Ataxin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化。3 Gy的X射線照射4 h后Ataxin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平開始增加，照射48 h后仍保持較高的表達(dá)水平(P<0.05)。見表3、4。

表3　電離輻射照射后不同時(shí)間點(diǎn)Ataxin-1

與0 h相比，*P<0.05。

表4　電離輻射照射后不同時(shí)間點(diǎn)Ataxin-1 mRNA

與0 h相比，*P<0.05。

3討論

SCA1基因位于染色體6p22-23, 基因組跨度450Kb，cDNA長(zhǎng)11Kb，含9個(gè)外顯子。SCA1基因外顯子中含有CAG(編碼谷氨酸)重復(fù)序列，正常人的重復(fù)次數(shù)為6-38，可表達(dá)野生型Ataxin-1蛋白，含792-830個(gè)氨基酸殘基，估計(jì)分子量約為87 kDa, 其中含有一段由(CAG)n編碼的多聚谷氨酰胺鏈；CAG序列重復(fù)次數(shù)增多為40-83時(shí)，表達(dá)異常的突變型Ataxin-1蛋白。

核仁內(nèi)含物在聚集泛素和很多泛素蛋白酶體系統(tǒng)的成分與靶點(diǎn)上，包括腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子以及神經(jīng)退行性疾病涉及的一些蛋白(如Ataxin-1等)，類似于胞漿的aggresomes-胞漿包涵體，這被稱為“核仁aggresomes”即核仁包涵體[4]。編碼谷氨酰胺的三核苷酸n重復(fù)序列異常擴(kuò)增導(dǎo)致過度拷貝的多聚谷氨酰胺鏈(PolyQ)形成，致使含有多聚谷氨酰胺鏈的突變型Ataxin-1蛋白與神經(jīng)元內(nèi)正常蛋白相互作用并在細(xì)胞核內(nèi)沉積形成核仁包涵體，產(chǎn)生神經(jīng)損害癥狀[2-3], 這種作用隨CAG數(shù)目增加而增強(qiáng)。而野生型Ataxin-1則通常被認(rèn)為與SCA1的發(fā)病無關(guān)，但Huda Zoghbi[7]研究發(fā)現(xiàn)，將攜帶80個(gè)重復(fù)的異常的Ataxin-1蛋白引入小鼠，從而造成了浦肯野細(xì)胞發(fā)生了退化并導(dǎo)致小鼠發(fā)生共濟(jì)失調(diào)，當(dāng)將攜帶30個(gè)重復(fù)的大量正常蛋白引入小鼠還能導(dǎo)致異常的神經(jīng)元功能。這意味著正常的和突變形式的Ataxin-1都具有一定程度上類似的功能，但突變形式更加有效，而在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，正常蛋白的水平過高時(shí)也會(huì)變成毒素。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ataxin-1在神經(jīng)系統(tǒng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有著不同水平的表達(dá)，以U251、A172為高，U87表達(dá)稍低，U373最低，不同細(xì)胞株中表達(dá)水平存在明顯差異。通過Western blot及PCR法發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87，在受到不同

梯度輻射劑量處理后，Ataxin-1蛋白及mRNA表達(dá)水平隨著劑量的增加而增加，在3 Gy時(shí)開始有明顯變化。隨后采用6MV-X射線照射U251、U87細(xì)胞株3 Gy, 并檢測(cè)照射后0、4、16、24、48 h時(shí)的蛋白及mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Ataxin-1蛋白及mRNA表達(dá)量在照射后4～16 h開始升高，并持續(xù)到24 h, 24 h到48 h保持較高的表達(dá)水平。以上結(jié)果說明Ataxin-1的表達(dá)與輻射劑量相關(guān)，一定范圍內(nèi)輻射劑量的增加可以誘導(dǎo)其表達(dá)的升高，且在電離輻射后4～16 h內(nèi)即激活啟動(dòng)子，開始大量表達(dá)。Ataxin-1呈現(xiàn)出一些放射損傷反應(yīng)基因的特點(diǎn)，在電離輻射后表達(dá)水平產(chǎn)生變化，且與劑量相關(guān)。

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Influence of ionizing radiation on the expression of Ataxin-1 in human glioma cancer cell lines

XU Enci, DAI Kejun, OU Yao, TANG Hua

(DepartmentofTumorRadiotherapy,ChangzhouTumorHospital,Changzhou,Jiangsu, 213000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of ionizing radiation on the expression of Ataxin-1 in U251 and U87 of human glioma cancer cells lines. MethodsDifferences of Ataxin-1 expression in A172, U251, U373, U87 of human glioma cancer cells lines were detected by Western blot, and U251, U87 were selected as research object. Changes of Ataxin-1mRNAand protein level were detected by RT-PCR and western blot. ResultsThe different kinds of glioma cancer cells had different levels of the Ataxin-1 expression. The expression level of Ataxin-1 significantly increased in both mRNA (P<0.05). For time-dependent induction of Ataxin-1, the expression significantly increased 4 hours after exposed to X-rays (P<0.05). Conclusion The expression level of Ataxin-1 is significantly different in 4 kinds of glioma cancer cells. Ionizing radiation can up-regulate the expression of Ataxin-1 in glioma cancer cells in both mRNA and protein levels. Ataxin-1 may be a molecular target for radiotherapy in glioma cancer，and may have a potential value to evaluate the curative effects of radiotherapy.

KEYWORDS:Ataxin-1; glioma cancer; influence

通信作者:湯華

收稿日期:2015-07-01

中圖分類號(hào):R 739.41

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)21-070-03DOI: 10.7619/jcmp.201521019