李梅 黨雙鎖 田長(zhǎng)印 翟嵩 賈曉黎 趙文學(xué) 張欣 潘國(guó)英 王媛 高寧

肝硬化失代償期是多種慢性肝病的終末期狀態(tài)，內(nèi)科治療效果差，病死率較高。目前，最為有效的治療方法是原位肝移植，但因供肝嚴(yán)重缺乏、移植后排斥反應(yīng)、高額的治療費(fèi)等因素嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)隨著干細(xì)胞的深入研究，干細(xì)胞移植治療肝硬化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意，有可能成為除肝移植外治療肝硬化的有效手段。本研究對(duì)42例肝硬化失代償期患者進(jìn)行分組設(shè)計(jì)，平行對(duì)照觀察評(píng)價(jià)自體外周血干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化的有效性及安全性。

資料和方法

一、一般資料

選擇2012年4月至2014年2月于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院住院治療的42例失代償期肝硬化患者，分為自體干細(xì)胞移植組和對(duì)照組。干細(xì)胞移植組20例，男女比例1.2∶1，年齡39～68歲(平均51.9歲)，其中乙肝肝硬化14例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例，其他原因所致肝硬化1例，Child-Pugh分級(jí)B級(jí)18例，C級(jí)2例。對(duì)照組22例，男女比例1.2∶1，年齡 38 ～70 歲(平均 52.5 歲)，其中乙肝肝硬化14例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例，自身免疫性肝炎肝硬化2例，其他原因所致肝硬化1例，Child-Pugh分級(jí)B級(jí)19例，C級(jí)3例。兩組患者性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者住院期間，均予以內(nèi)科對(duì)癥支持治療，包括保肝、利尿、限制水鈉攝入等。治療方案得到醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，且在患者及家屬充分知情的情況下進(jìn)行，簽署知情同意書(shū)。

二、納入標(biāo)準(zhǔn)

臨床診斷均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》有關(guān)肝硬化的標(biāo)準(zhǔn)［1］。

排除上消化道出血、肝性腦病、原發(fā)性肝癌以及妊娠者。

三、自體外周血干細(xì)胞移植

(一)外周血干細(xì)胞(peripheral blood stem cell，PBSC)采集:予重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CGF，白特喜，山東科興生物制品有限公司)300μg/d，皮下注射，連續(xù)3～4 d，進(jìn)行PBSC動(dòng)員。監(jiān)測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)外周血白細(xì)胞≥10.0×109/L，單核細(xì)胞≥1.0×109/L，滿足采集條件。動(dòng)員期間觀察有無(wú)發(fā)熱、骨痛、乏力、皮疹、胃腸道反應(yīng)、自發(fā)性脾破裂、嚴(yán)重化膿性感染、高凝狀態(tài)等。應(yīng)用美國(guó)Spectra血細(xì)胞分離機(jī)采集PBSC懸液100 mL。采集過(guò)程中觀察患者有無(wú)低鈣性口周麻木、抽搐、迷走神經(jīng)反應(yīng)性面色蒼白、低血容量性面色蒼白、暈厥等不良反應(yīng)。分離的PBSC 4℃保存，于4 h內(nèi)行移植術(shù)。

(二)經(jīng)肝動(dòng)脈行自體PBSC肝臟移植術(shù):術(shù)前6 h行碘過(guò)敏試驗(yàn)、雙側(cè)腹股溝備皮。經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插管，置管于肝固有動(dòng)脈進(jìn)行造影，觀察肝內(nèi)血管情況并排除占位性病變。將干細(xì)胞懸液約100 mL經(jīng)肝動(dòng)脈緩慢注入;術(shù)畢拔管，穿刺點(diǎn)加壓包扎后返回病房，穿刺側(cè)下肢制動(dòng)6 h，臥床24 h。

四、療效觀察

治療后隨訪4、8、12、24周，觀察臨床癥狀變化(乏力、納差、腹脹)，TBil、ALT、AST、Alb、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)及Child評(píng)分。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件分析。計(jì)量資料以 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、術(shù)后患者一般情況

干細(xì)胞移植組20例患者中17例乏力、納差癥狀減輕，15例腹脹減輕，3例患者自覺(jué)癥狀無(wú)明顯改善。對(duì)照組22例患者中17例乏力、納差、腹脹癥狀減輕，5例無(wú)明顯變化。

二、治療后患者肝功能的變化

見(jiàn)表1。治療后8周、12周、24周，干細(xì)胞移植組白蛋白較術(shù)前及對(duì)照組明顯回升。

三、治療后患者凝血功能及Child評(píng)分的變化

見(jiàn)表2。術(shù)后12周、24周細(xì)胞移植組凝血酶原活動(dòng)度以及術(shù)后24周細(xì)胞移植組凝血酶原時(shí)間較術(shù)前明顯改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后12周、24周Child評(píng)分較術(shù)前及對(duì)照組明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、并發(fā)癥

干細(xì)胞移植組術(shù)后出現(xiàn)發(fā)熱2例，穿刺部位瘀斑2例，1例于術(shù)后第2天出現(xiàn)欣快、行為異常，血氨升高，第4天恢復(fù)正常(既往曾出現(xiàn)肝性腦病)，1例術(shù)后第3天出現(xiàn)黑便，第4天緩解(既往曾出現(xiàn)上消化道出血)。其余患者術(shù)中及術(shù)后未出現(xiàn)特殊不適。

五、預(yù)后

干細(xì)胞移植組20例患者中，2例患者于術(shù)后6個(gè)月死于肝功能衰竭，1例患者于術(shù)后8個(gè)月死于上消化道出血。對(duì)照組22例患者中，1例死于肝腎綜合征，1例死于肝性腦病，1例死于上消化道出血。

討 論

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的細(xì)胞，具有廣泛遷移和特異的定向特性，能優(yōu)先定位種植于適當(dāng)?shù)奈h(huán)境內(nèi)而增殖分化，目前已用于多種疾病的治療，如造血干細(xì)胞移植治療白血病、缺血性心臟病、缺血性下肢血管病等。近年來(lái)，骨髓干細(xì)胞移植、臍血干細(xì)胞移植、間充質(zhì)干細(xì)胞移植等應(yīng)用于治療慢性肝病的實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察方興未艾，并有成功案例報(bào)道。姚鵬等［2］報(bào)道自體骨髓干細(xì)胞經(jīng)肝動(dòng)脈移植治療30例失代償期肝硬化患者，術(shù)后12周患者自覺(jué)癥狀和肝功能在一定程度上改善。Tetai等［3］報(bào)道9例肝硬化患者的自體骨髓干細(xì)胞移植治療后，24周血清白蛋白及總蛋白水平均明顯提高。韋玲等［4］通過(guò)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療1例失代償期肝硬化患者，發(fā)現(xiàn)肝功能明顯改善且肝細(xì)胞脂肪變性及肝纖維化明顯減輕。

表1 兩組患者治療前后肝功能變化(±s)

注:與術(shù)前比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與細(xì)胞移植組比較，c P ＜0.05

組別 例數(shù) TBil(μmol/L) ALT(U/L) AST(U/L) Alb(g/L)干細(xì)胞移植組20術(shù)前 33.93 ±17.83 49.82 ±39.47 76.36 ±62.68 30.49 ±2.75術(shù)后4 周 40.42 ±23.77 41.78 ±18.87 71.78 ±42.12 33.76 ±4.48術(shù)后8 周 35.49 ±28.73 36.50 ±26.95 56.80 ±39.98 34.40 ±3.59a術(shù)后12 周 32.04 ±17.68 37.00 ±18.78 48.56 ±19.26 37.03 ±3.82b術(shù)后24 周 30.54 ±18.84 38.10 ±18.56 58.90 ±35.28 36.18 ±5.42b對(duì)照組 22術(shù)前 37.74 ±26.10 49.55 ±35.33 63.09 ±38.46 31.52 ±3.32術(shù)后4 周 34.43 ±19.16 49.17 ±27.66 71.19 ±35.02 33.41 ±2.34術(shù)后8 周 38.63 ±21.99 41.55 ±25.69 70.82 ±46.58 30.19 ±4.04c術(shù)后12 周 48.40 ±45.38 37.27 ±30.24 64.55 ±52.93 31.68 ±3.06c術(shù)后24 周 63.51 ±50.79 41.82 ±32.23 67.64 ±41.79 33.46 ±3.29c

表2 兩組患者治療前后凝血功能及Child評(píng)分變化(±s)

表2 兩組患者治療前后凝血功能及Child評(píng)分變化(±s)

注:與術(shù)前比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與對(duì)照組比較，c P ＜0.01

Child干細(xì)胞移植組組別 例數(shù) PT(S) PTA(%)66 20術(shù)前 16.67 ±3.13 52.41 ±14.34 8.10 ±1.07術(shù)后4 周 15.34 ±2.55 58.40 ±16.02 7.65 ±0.82術(shù)后8 周 15.34 ±2.27 58.07 ±11.74 7.35 ±0.58b術(shù)后12 周 14.50 ±1.81 65.99 ±11.22a 6.90 ±0.55bc術(shù)后24 周 13.98 ±1.34a 70.08 ±13.27b 6.15 ±0.58bc對(duì)照組 22術(shù)前 14.77 ±1.74 67.54 ±8.58 8.09 ±1.10術(shù)后4 周 13.91 ±1.09 63.04 ±13.92 7.81 ±0.85術(shù)后8 周 15.23 ±1.71 61.56 ±12.02 7.78 ±0.86術(shù)后12 周 14.36 ±1.64 62.24 ±14.71 7.82 ±0.73術(shù)后24 周 14.84 ±2.18 65.62 ±15.68 8.18 ±0.

本研究用自體外周血干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化20例，均獲成功，未發(fā)現(xiàn)有并發(fā)癥或不良事件發(fā)生。整個(gè)治療主要抓住兩個(gè)關(guān)鍵:其一是外周血干細(xì)胞有效適時(shí)的采集，把握粒細(xì)胞刺激因子給予的量及選擇采集的時(shí)間是干細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵;其二是干細(xì)胞移植，在介入條件下經(jīng)股動(dòng)脈插管至肝動(dòng)脈，注入分離好的外周血干細(xì)胞懸液。在臨床實(shí)際應(yīng)用中要取得最佳療效仍然有很多客觀標(biāo)志物要觀察，如CD34細(xì)胞測(cè)定就非常重要。

本研究中外周血干細(xì)胞移植的失代償期肝硬化患者術(shù)后8、12、24周白蛋白較對(duì)照組明顯回升;術(shù)后12、24周Child評(píng)分較術(shù)前及對(duì)照組明顯改善;凝血酶原活動(dòng)度及凝血酶原時(shí)間較術(shù)前有所改善，與國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果基本一致［2，5，6］。分析有效性原因:①與干細(xì)胞移植后在肝臟微環(huán)境下分化形成成熟肝細(xì)胞發(fā)揮替代功能有關(guān);②干細(xì)胞移植改變肝臟免疫微環(huán)境［7］，下調(diào)免疫介導(dǎo)的肝損傷;③與干細(xì)胞的旁分泌功能有關(guān)，可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞(HSC)功能。Tanimoto等［8］研究提示，干細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)TNFα、TGFβ的水平抑制HSC的活化從而改善肝纖維化。因此移植干細(xì)胞將有可能修復(fù)損傷的肝硬化組織，促進(jìn)肝組織結(jié)構(gòu)重建。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在干細(xì)胞移植肝臟后，不僅可以在肝臟特定的環(huán)境下分化為肝系細(xì)胞，還可以分泌一些細(xì)胞因子，降解纖維化肝組織，參與肝臟的修復(fù)［9，10］。

在本研究中干細(xì)胞移植患者的安全性也得到進(jìn)一步證實(shí)。Mohamadnejad等［11］對(duì)32例自體骨髓干細(xì)胞移植的患者進(jìn)行為期20.5個(gè)月的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植并未增加肝癌的發(fā)生率。因此，自體干細(xì)胞移植為大多數(shù)終末期肝病患者提供了一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的微創(chuàng)治療方法。尤其在目前白蛋白及凝血酶極為缺乏的現(xiàn)狀下，鼓勵(lì)推廣應(yīng)用就顯得迫切。當(dāng)然，值得注意的是干細(xì)胞移植雖然是微創(chuàng)治療，但對(duì)于有明顯的脾功能亢進(jìn)者、病情相對(duì)危重者應(yīng)慎用或者不用，其臨床的遠(yuǎn)期安全性仍有待進(jìn)一步評(píng)估。隨著同行們深入的開(kāi)展、更多的臨床觀察總結(jié)會(huì)為更加規(guī)范、更加有效的應(yīng)用干細(xì)胞移植手段治療肝硬化失代償期患者提供有效依據(jù)。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)會(huì)和肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志，2001，19:56-62.

2 姚鵬，王帥，胡大榮，等.肝動(dòng)脈自體骨髓干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化30例.世界華人消化雜志，2001，13:1639-1640.

3 Terai S，Ishikawa T，Omori K，et al.Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bonemarrow cell infusion therapy.Stem Cells，2006，24:2292-2298.

4 韋玲，王莉，李佳，等.干細(xì)胞移植治療肝硬化1例.世界華人消化雜志，2012，20:528-530.

5 Gordon MY，Levicar N，Pai M，et al.Characterization and clinical application ofhuman CD34+stem/progenitor cellpopulationsmobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor.Stem Cells，2006，24:1822-1830.

6 Piscaglia AC，Shupe TD，Oh SH，et al.Granulocyte-colony stimulating factor promotes liver repair and induces oval cellmigration and proliferation in rats.Gastroenterology，2007，133:619-631.

7 崔麗娜，韓英.多能干細(xì)胞在肝臟損傷和修復(fù)過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)作用.臨床肝膽病雜志，2014，30:855-859.

8 Tanimoto H，Terai S，Taro T，et al.Improvement of liver fibrosis by infusion of cultured cells derived from human bonemarrow.Cell Tissue Res，2013，354:717-728.

9 Lan L，Chen Y，Sun C，et al.Transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells transduced with adenovirus-mediated IL-10 gene reverses liver fibrosis in rats.Transpl Int，2008，21:581-592.

10 Dai LJ，Li HY，Guan LX，et al.The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis.Stem Cell，Res 2009，2:16-25.

11 Mohamadnejad M，Ashrafi M，Alimoghaddam K，et al.Surveillance for hepatocellular carcinoma after autologous stem cell transplantation in cirrhosis.Middle East JDig Dis，2012，4:145-149.

(本文編輯:錢(qián)燕)