堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在大鼠腮腺萎縮和再生過(guò)程中的表達(dá)及意義

劉士維，盧浩，柳康，張賜童，劉麒麟，孫賓，張偉*

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

頭頸部的放射治療、炎癥等常會(huì)引起涎腺分泌功能障礙，影響患者的生活質(zhì)量，因此，治療涎腺萎縮，促進(jìn)腺體功能恢復(fù)日益引起人們的重視。堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的促血管生成因子和促創(chuàng)傷修復(fù)因子之一[1]，已有國(guó)外學(xué)者研究表明bFGF在大鼠下頜下腺中有表達(dá)并可以促進(jìn)下頜下腺組織修復(fù)[2]。與下頜下腺相比，腮腺在組織結(jié)構(gòu)以及功能上與其有一定的區(qū)別，雖有學(xué)者已證實(shí)bFGF存在于大鼠的腮腺組織中[3]，但對(duì)bFGF在腮腺組織萎縮及再生過(guò)程中表達(dá)變化及生理功能的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立Wistar大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎和再通模型[4]，研究在此過(guò)程中bFGF的表達(dá)及與腮腺細(xì)胞增殖的線性關(guān)系。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

7周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠84只，體重約200-250 g，購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。84只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組——空白對(duì)照組6只(不做任何處理)、腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎組42只及主導(dǎo)管結(jié)扎再通組36只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2腮腺創(chuàng)傷和再生模型的建立

結(jié)扎組和再通組大鼠10%水合氯醛3 mL·kg-1行腹腔麻醉，游離腮腺主導(dǎo)管和伴行的面神經(jīng)頰支，用1號(hào)線雙重結(jié)扎主導(dǎo)管，皮膚對(duì)位縫合。術(shù)后給予200單位青霉素，回籠常規(guī)飼養(yǎng)。結(jié)扎組大鼠在術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d、60 d處死，沿腮腺主導(dǎo)管切取右側(cè)腮腺，立即放置4%多聚甲醛溶液中固定，再通組大鼠在導(dǎo)管結(jié)扎第14天取出結(jié)扎線，確保導(dǎo)管再通，分別于再通后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d處死，同樣方法獲取腮腺標(biāo)本。

1.3組織學(xué)觀察

腮腺標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定24h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，制成4 μm切片，行蘇木精—伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，置于光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.4免疫組織化學(xué)觀察

應(yīng)用UltraSensitiveTM SP法免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，試劑：兔抗鼠多克隆抗體(bFGF)(購(gòu)于武漢博士德公司，中國(guó))、兔抗鼠多克隆抗體PCNA抗體(購(gòu)于Immunoway公司，美國(guó))，抗體濃度稀釋1∶200。方法:蘇木精輕度復(fù)染、鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)，鏡下觀察bFGF、PCNA的表達(dá)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

2結(jié)果

2.1大鼠腮腺結(jié)扎后與再通后的形態(tài)學(xué)改變

結(jié)扎組：導(dǎo)管結(jié)扎1天后腺體體積較正常腺體增大，隨后2天有縮小趨勢(shì)，第3天大至恢復(fù)正常大小，第7天時(shí)腺體明顯萎縮，至28天時(shí)萎縮到正常腺體三分之二，顏色加深，質(zhì)地變硬，腺小葉結(jié)構(gòu)模糊。

再通組：主導(dǎo)管再通后，腺體顏色、體積、質(zhì)地逐漸恢復(fù)正常，再通后14天時(shí)，腺體外觀已恢復(fù)至正常腺體相近。

2.2組織學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1正常腮腺：腺體表面覆有被膜并且深入到腺體內(nèi)，將腺體分隔開(kāi)，形成許多腺葉和腺小葉，腺體是由腺泡細(xì)胞組成，腺泡細(xì)胞大小均勻，規(guī)則排列，其周圍廣泛散在有導(dǎo)管(包括閏管、紋管及排泄管)(見(jiàn)圖1A)。

2.2.2結(jié)扎組：第1天時(shí)可見(jiàn)導(dǎo)管稍有擴(kuò)張，但腺體無(wú)實(shí)質(zhì)性改變；3天時(shí)導(dǎo)管增多，腺泡減少，腺小葉出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂；5天、7天時(shí)腺泡細(xì)胞繼續(xù)萎縮、減少，導(dǎo)管擴(kuò)張，出現(xiàn)導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1B)；14天時(shí)，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)更多，少數(shù)的腺泡細(xì)胞分布在小葉邊緣，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；28天時(shí)，腺泡細(xì)胞幾乎全部消失，腺體幾乎全部是導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，且相鄰導(dǎo)管間有發(fā)生融合的傾向(見(jiàn)圖1C)。

2.2.3再通組：第1天時(shí)萎縮的腺體未發(fā)生明顯改變,還可見(jiàn)大量擴(kuò)張的導(dǎo)管(見(jiàn)圖1D)；第3天時(shí)導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)減少；5天時(shí)，腺小葉周圍出現(xiàn)新生的腺泡增多，且體積增大，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少(見(jiàn)圖1D)；7天時(shí)，新生的腺泡已占絕大多數(shù)，形態(tài)趨近正常，但排列不夠密實(shí)；14天、28天時(shí)腺泡細(xì)胞充盈，腺小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)近似正常(見(jiàn)圖1F)。

圖1　　大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎及再通術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的

2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.3.1bFGF免疫組化染色結(jié)果

①bFGF正常腮腺：在正常腺體中bFGF主要在導(dǎo)管上皮細(xì)胞和部分腺泡細(xì)胞中散在陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖2A)。

②結(jié)扎組：主導(dǎo)管結(jié)扎后bFGF的吸光度值增加，3天達(dá)峰值(0.177±0.010),主要在腺泡細(xì)胞的胞漿和基質(zhì)中表達(dá)，隨后bFGF的表達(dá)漸平穩(wěn)，7天后在腺泡細(xì)胞的基底膜和導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍表達(dá)。bFGF在各點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)圖2B、C及表1，與正常腮腺相比較二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

③再通組：主導(dǎo)管再通1d后腺泡細(xì)胞吸光度值增加，3d達(dá)峰值(0.288±0.027)，且主要在新生腺泡細(xì)胞的胞漿和導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，7d后表達(dá)下降，導(dǎo)管細(xì)胞的bFGF表達(dá)維持在較恒定的水平。bFGF在各點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)圖2D、E、F及表1，與正常腮腺相比較二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2　　大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎及再通術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的

2.3.2PCNA免疫組化染色結(jié)果

①結(jié)扎組：在結(jié)扎3天后PCNA的表達(dá)顯著上升，在腺泡和導(dǎo)管中都有表達(dá)，5天后腺泡細(xì)胞中PCNA達(dá)到峰值，隨后降低并保持穩(wěn)定。PCNA在不同時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)圖3A、B、C及表2。

②再通組：在導(dǎo)管再通1天PCNA的平均陽(yáng)性表達(dá)上升，5天達(dá)到峰值，7天后降低并趨于平穩(wěn)。PCNA在不同時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)圖3D、E、F及表2。

±s)

a:與0 d相比，P<0.05;b:與3 d相比，P<0.05; c:與5 d相比，P<0.05;*:Welch檢驗(yàn) #：Kruskal-Wallis檢驗(yàn)

±s)

a:與0 d相比，P<0.05;b:與5 d相比，P<0.05;*:Welch檢驗(yàn)

圖3　大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎及再通術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的PCNA

3討論

腮腺是口腔三大涎腺之一，其萎縮后的再生及功能的恢復(fù)較為復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腮腺主導(dǎo)管進(jìn)行結(jié)扎和再通，來(lái)建立腮腺萎縮和再生模型[4]，在此過(guò)程中觀察到的典型變化為：主導(dǎo)管結(jié)扎后腮腺腺泡萎縮，數(shù)量減少、消失，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)增多，bFGF的吸光度值逐漸升高；主導(dǎo)管再通后導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)減小，消失，腺泡細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常，bFGF的吸光度值先升高再減低。對(duì)于腺體萎縮過(guò)程中，腺泡減少、消失，不同學(xué)者觀點(diǎn)不同，有人認(rèn)為腺泡細(xì)胞分化成了導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)[5-7]。有人認(rèn)為是其自身凋亡所至，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶在凋亡過(guò)程中起主要作用[8]。導(dǎo)管再通后腺泡細(xì)胞重新出現(xiàn)，對(duì)于新生的腺泡可能來(lái)源于殘留在萎縮腺體中的腺泡再分化，也可能來(lái)源于剩余導(dǎo)管細(xì)胞的增殖和再分化[4]。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是一種生物性極強(qiáng)的多肽因子，最早是1995年vanSettenGB在唾液中檢測(cè)到的。有研究證實(shí)[3]腮腺的腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生bFGF，產(chǎn)生的bFGF存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。在正常狀態(tài)下并不活躍，一旦損傷刺激出現(xiàn)，其就被激活并大量釋放[9]，且已存在的bFGF還會(huì)刺激分泌它的細(xì)胞產(chǎn)生更多的bFGF[10]。本研究觀察到腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎1 d、3 d后，bFGF陽(yáng)性表達(dá)增加，在第3天時(shí)達(dá)到峰值，隨后陽(yáng)性表達(dá)降低但保持平穩(wěn)，原因可能是因?yàn)楫?dāng)損傷刺激出現(xiàn)后，激發(fā)了細(xì)胞基質(zhì)中bFGF的前體使其大量釋放，雖然產(chǎn)生bFGF的腺泡細(xì)胞的不斷萎縮，數(shù)量減少，但已經(jīng)釋放出來(lái)的bFGF會(huì)刺激腺泡細(xì)胞產(chǎn)生更多的bFGF,但隨著大量腺泡細(xì)胞萎縮、消失，分泌功能降低，而導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的bFGF較平穩(wěn)，故總體bFGF表達(dá)下降。而主導(dǎo)管再通后隨著腺泡細(xì)胞的恢復(fù)、再生，分泌bFGF的量也增加，在導(dǎo)管再通3d時(shí)達(dá)到峰值，同時(shí)分泌的bFGF也為腺泡細(xì)胞的增生提供條件，但隨著損傷刺激去除的時(shí)間延長(zhǎng)，腺體逐漸恢復(fù)正常，bFGF的表達(dá)也趨于穩(wěn)定。主導(dǎo)管由結(jié)扎到再通，bFGF的表達(dá)部位由腺泡細(xì)胞的胞漿和基質(zhì)，到腺泡細(xì)胞的基底膜和導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍，再到新生腺泡細(xì)胞的胞漿和導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞，可能是由于腺泡細(xì)胞的萎縮凋亡，產(chǎn)生的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)作為分泌單位去分化的產(chǎn)物，在導(dǎo)管再通后又重新分化為腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞[11]的緣故。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：主導(dǎo)管結(jié)扎1 d后，PCNA的表達(dá)開(kāi)始有所增強(qiáng)，3 d后PCNA的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，可看見(jiàn)大量細(xì)胞核有絲分裂像，在第5 d達(dá)到峰值，7 d后下降并保持穩(wěn)定，而bFGF的分泌從1 d后開(kāi)始增強(qiáng)，3 d達(dá)到峰值，隨后降低并保持穩(wěn)定，說(shuō)明bFGF能夠刺激細(xì)胞發(fā)生有絲分裂,是一種強(qiáng)絲裂原，并且可以調(diào)控和穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),延長(zhǎng)細(xì)胞存活期，這與Hom DB[12]和LObb RR[13]的觀點(diǎn)一致。主導(dǎo)管再通后，PCNA和bFGF的線性關(guān)系跟結(jié)扎組一致，筆者認(rèn)為原因有可能是bFGF激發(fā)了導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)向腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化，刺激了新生腺泡細(xì)胞的增殖[10]，還有可能是因?yàn)閎FGF影響細(xì)胞周期,使更多量的細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)[14]，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。值得一提的是，在上述過(guò)程中，高度分化的肌上皮細(xì)胞也發(fā)生有絲分裂，且數(shù)量逐漸增多，此與Redman的報(bào)道相一致[15]。

綜上，在腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎和再通的過(guò)程中，腺泡細(xì)胞由萎縮、消失到再生、恢復(fù)正常狀態(tài)，腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化，bFGF與細(xì)胞增殖成正相關(guān)性。通過(guò)研究bFGF在腮腺萎縮及再生中的表達(dá)和意義，對(duì)唾液腺的萎縮治療提供新的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Folkman J,klagskrun M.Angiogenic factors[J].Science,1987,235:442.

[2]Y Okazaki,H Kagami,T Hattori,et al.Acceleration of rat salivary glands tissue repair by basic fibroblast growth factor[J].Archives of Oral Biology,2000,45:911．

[3]Osamu Amano,Yoshino Yoshitake,Katsuzo Nishikawa,et al.Basic fibroblast growth factor in rat salivary glands[J].Cell Tissue Res,1993,273:467．

[4]Takahashi S，Schoch E,Walker NI.Origin of acinar cell regeneration after atrophy of the rat parotid induced by duct obstruction[J].Int J Exp Pathol,1998,79(5):293.

[5]Standish SM,Shafer WG.Serial histologic effects of rat submaxillary and sublingual salivary gland duct and blood vessel ligation[J].J Dent Res,1957,36(6):866.

[6]Tamarin A.Submaxillary gland recovery from obstruction.I.Overall changes andelectron microscopic alterations of granular duct cells[J].J Ultrastruct Res,1971,34(3):276.

[7]Tamarin A.Submaxillary gland recovery from obstruction.II.Electron microscopic alterations of acinar cells [J].J Ultrastruct Res,1971,34(3):288.

[8]Takahashi S,Gobe GC,Yoshimura Y，et al.Participation of the Fas and Fasligand systems in apoptosis during atrophy of the rat submandibular glands[J].Int J Exp Pathol,2007,88(1):9.

[9]Santiago FS,Lowe HC,Day FL,et al.Early growth response factor-1 induction by injury is triggered by release and paracrine activetion by fibroblast growth factor-2[J].Am J Pathol,1999,154:937．

[10]Schweigerer L,Neufeld G,Friedman J,et al．Capillary endothelial cells express basic flbroblast growth factor,a mitogen that promotes their owngrowth[J].Nature,1987(112)：835.

[11]Takahashi S，Shinzato K，Nakamura S，et al.Cell death and cell proliferation in the regeneration of atrophied rat submandibular glands after duct ligation[J].Oral Pathol Med，2004,33(1)：23.

[12]Hom DB,Maisel RH.Angiogenic growth factors:their effects and potential in soft tissue wound healing[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,1992,101:349.

[13]LObb RR,Alderman ER,Fett JW.lnduction of angiongenesis bv bovine brain derived class heparinbinding growthfactor[J].Biochenistry,1985,24:49.

[14]周延沖,主編.多肽生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)與臨床[M].北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1992:26.

[15]Redman RS.Myoepithelium of salivary glands[J].Micros Res Tech,1994,27:25.

收稿日期：(2013-11-19)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)03-0359-04

通訊作者*