楊江華，朱曉玥，王文節(jié)

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院 感染性疾病科，安徽 蕪湖241001)

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免疫熒光染色法檢測結(jié)核分支桿菌的建立與臨床應(yīng)用

楊江華，朱曉玥，王文節(jié)

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院 感染性疾病科，安徽 蕪湖241001)

摘要：目的建立免疫熒光染色法特異性檢測結(jié)核分支桿菌，提高痰涂片陰性肺結(jié)核患者的診斷率。方法隨機(jī)選取浸潤型肺結(jié)核患者57例作為實(shí)驗(yàn)組，其中痰涂片抗酸染色陽性患者28例，痰涂片陰性患者29例；對照組13例，為呼吸道其它細(xì)菌感染者。受檢者晨起留取痰液，高溫高壓后與標(biāo)本等量的5%次氯酸鈉溶液混合，離心后分別行直接涂片抗酸染色檢查或免疫熒光染色法檢查。結(jié)果57例浸潤型肺結(jié)核患者中，28例痰涂片抗酸染色檢查陽性，免疫熒光染色法檢測仍陽性；在29例痰涂片陰性肺結(jié)核患者中，免疫熒光染色法檢測15例陽性。13例呼吸道其他細(xì)菌感染者者經(jīng)免疫熒光染色法檢測與抗酸染色均為陰性。結(jié)論免疫熒光染色法檢測結(jié)核分枝桿菌具有特異性，顯著提高痰菌陰性肺結(jié)核的診斷率。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0775)

結(jié)核病已經(jīng)成為我國重大的傳染病之一，是嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳播疾病。據(jù)WHO的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)告，我國不僅僅是世界范圍內(nèi)22個(gè)結(jié)核病流行最嚴(yán)重國家之一，同時(shí)也是27個(gè)耐結(jié)核病藥物流行嚴(yán)重的國家之一。目前，我國結(jié)核病的年發(fā)病人數(shù)高達(dá)130萬，約占全球發(fā)病人數(shù)的14.3%，位居全球的第二位。根據(jù)我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)的抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，2010年15歲及以上肺結(jié)核人群的患病率為459/10萬，其中傳染性肺結(jié)核患病率為66/10萬。因此，結(jié)核病已經(jīng)成為我國危害人們健康最嚴(yán)重的呼吸道傳染病。結(jié)核病防控重要措施之一在于結(jié)核病的診斷，尤其是對痰涂片陰性肺結(jié)核的診斷率意義尤為重大。因此建立簡便，快捷，特異的痰菌陰性結(jié)核病診斷方法成為控制結(jié)核病蔓延的首要任務(wù)。本研究擬建立了特異性免疫熒光染色法( immunofluorescence assay，IFA)檢測結(jié)核分枝桿菌，以期提高肺結(jié)核，尤其是痰菌陰性肺結(jié)核的診斷率。

1材料與方法

1.1病例選擇選取浸潤型肺結(jié)核患者57例，其中痰涂片抗酸染色陽性患者28例，痰涂片陰性患者29例。符合2001年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[1]診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集患者相關(guān)資料如臨床癥狀、體征、血常規(guī)、血生化，細(xì)菌學(xué)以及影像學(xué)結(jié)果等。對照組13例，通過細(xì)菌學(xué)檢查診斷為其它細(xì)菌性肺炎患者。

1.2直接涂片抗酸染色檢測囑患者連續(xù)3 天晚上睡覺前清水漱口，次日清晨再次用生理鹽水漱口，咳出深部痰液，合格標(biāo)本量不少于1 ml，留于潔凈標(biāo)本瓶中，高壓滅菌后加入與標(biāo)本等量的5%次氯酸鈉溶液，采用振蕩器混勻，混合10 min，倒入潔凈離心試管中，以3 000 r/min，離心10 min，棄去上部液體，將剩余沉渣0.1 ml放入載玻片中央處，然后將其均勻涂抹為卵圓形痰膜，讓其自然干燥；后痰涂片火焰固定，置于染色架上；加染色劑浸滿痰膜，微火加溫染液，染色5-10 min，水洗；加脫色劑脫色3-5 min，至無紅色，然后水洗，自然涼干，顯微鏡下檢測，結(jié)果報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2]。

1.3免疫熒光染色法檢測痰標(biāo)本經(jīng)5%次氯酸鈉溶液消化10 min,倒入潔凈離心試管中,以3 000 r/min,離心10 min，將上部液體棄去，1 ml PBS清洗1次，沉淀物加0.5 ml PBS，再加入1 μl熒光標(biāo)記抗抗酸桿菌抗體(Abcam公司產(chǎn)品)，4 ℃孵育30 min，離心，用PBS重懸，離心，取出將上部液體棄去,剩0.1 ml放入載玻片中央處，熒光顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

57例浸潤性肺結(jié)核患者痰涂片抗酸染色檢查，28例痰涂片抗酸染色陽性表現(xiàn)為細(xì)菌為紅色，呈短棒狀或桿狀痰標(biāo)本；但部分標(biāo)本因壞死組織較多及細(xì)菌存在于細(xì)胞內(nèi)，嚴(yán)重干擾檢測者的判斷(圖1 A)；痰標(biāo)本經(jīng)5%次氯酸鈉溶液消化后，背景消失，視野清晰(圖1 B)。28例抗酸染色陽性患者行免疫熒光染色檢查仍陽性，熒光染色鏡檢表現(xiàn)為結(jié)核分枝桿菌在暗色背景下會發(fā)出黃綠色熒光，非常醒目，容易辨認(rèn)(圖2 A)；29例直接涂片抗酸染色檢查陰性，經(jīng)免疫熒光染色15例檢查陽性(圖2 B)。13例普通細(xì)菌性肺炎患者痰液涂片抗酸染色與免疫熒光染色方法檢查，均未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。

圖1　 肺結(jié)核患者痰涂片直接抗酸染色陽性以及5%次氯酸鈉溶液消化后抗酸染色。

3討論

當(dāng)前我國在結(jié)核病控制方面首先面臨的問題是結(jié)核病的診斷，尤其是痰涂片陰性肺結(jié)核患者的診斷。肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有影像學(xué)檢查、細(xì)菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查以及分子生物學(xué)檢查等[1]。細(xì)菌學(xué)檢查依然是目前被認(rèn)為肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，主要有痰涂片抗酸染色直接找結(jié)核分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法。傳統(tǒng)的痰涂片抗酸染色檢查方法雖然操作簡單，但有其陽性率較低之不足。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法雖然敏感性較高，但存在培養(yǎng)時(shí)間長，成本高，以及需要特殊設(shè)備，重復(fù)性尚差的缺點(diǎn)。為此，本實(shí)驗(yàn)對傳統(tǒng)痰涂片抗酸染色方法進(jìn)一步改進(jìn)，5%的次氯酸鈉作為液化劑而使用。次氯酸鈉不僅具有滅菌的特性，也可以起到很好的生物安全防護(hù)作用，同時(shí)還可以最大限度的使痰標(biāo)本中抗酸桿菌濃集，破壞痰中雜菌以及壞死組織與細(xì)胞等，從而減少痰液中雜質(zhì)對染色的干擾。這些都有利于結(jié)核菌檢出率的提高。

圖2　痰涂片抗酸染色陽性及陰性肺結(jié)核患者免疫熒光染色。

免疫熒光法是建立在生物化學(xué)、免疫學(xué)和熒光顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)標(biāo)記檢驗(yàn)技術(shù)。其原理為將不影響抗原抗體活性的熒光素直接標(biāo)記到抗體上面，與樣本中相應(yīng)的特異性抗原結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光成像。由于免疫熒光法既不要求菌體是否有活力，也不需要進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)，因此具有顯著的臨床應(yīng)用前景。與其它快速檢測方法相比而言，此技術(shù)的特異性好、敏感性高、操作簡單、是快速檢測的首選方法之一。由于免疫熒光法操作簡便，操作時(shí)間短，因此在臨床上用于快速診斷傳染性疾病具有明確優(yōu)勢。同時(shí)高質(zhì)量特異性抗體的應(yīng)用也大大減少了非特異熒光染色的干擾，使該法敏感性和特異性得到進(jìn)一步提高。在本次試驗(yàn)中，我們選用的Abcam公司以PPD為免疫原FITC標(biāo)記的多克隆抗體，能夠特異性檢測結(jié)核分枝桿菌[3]。而國內(nèi)多數(shù)研究選用金胺O熒光染色,為非特異性染色劑[4]。從本次試驗(yàn)結(jié)果的分析可見， 我們使用20倍物鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察，陽性標(biāo)本即可顯現(xiàn)明亮的熒光顆粒，這不僅使結(jié)果判定更加直接、方便，而且由于觀測面積的擴(kuò)大，使菌量較少的標(biāo)本也可以被檢測出。在方法的應(yīng)用、推廣方面，相對傳統(tǒng)的抗酸染色，其操作過程更簡單，設(shè)備方面除熒光顯微鏡外，其它都是臨床檢驗(yàn)科常規(guī)實(shí)驗(yàn)所必須的，惟一不同的是需要結(jié)核分枝桿菌特異性的抗體。如果該方法規(guī)范、成熟后，有商品化特異性的標(biāo)記抗體出現(xiàn)，從而使該方法的操作更加簡單、快捷，且較抗酸染色更易于標(biāo)準(zhǔn)化，可廣泛應(yīng)用于肺結(jié)核患者的臨床檢測。

我們在該項(xiàng)研究中采用次氯酸鈉聯(lián)合免疫熒光法檢測結(jié)核分枝桿菌與抗酸染色進(jìn)行平行對比實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果明確，這一點(diǎn)不僅體現(xiàn)在檢出的陽性率方面免疫熒光染色法要高于抗酸染色，還在于它們之間的陽性標(biāo)本的吻合率以及特異性上。因此，從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，免疫熒光染色法要優(yōu)于抗酸染色法。由此，該方法將有助于提高痰涂片陰性肺結(jié)核的診斷效率，還可用于結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性膿腫等的診斷，能夠推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會.肺結(jié)核診斷和治療指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,24(2):70.

[2]中國防癆協(xié)會.結(jié)核病細(xì)菌性檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):28.

[3]Verway M1,Bouttier M,Wang TT,et al.Vitamin D induces interleukin-1β expression:paracrine macrophage epithelial signaling controls M.tuberculosis infection[J].PLoS Pathog,2013,9(6):e1003407.

[4]齊興峰,曾德華,鄭智勇.金胺O熒光染色和抗酸染色在結(jié)核病診斷中的聯(lián)合應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2010,26(6):763.

關(guān)鍵詞：肺結(jié)核；抗酸染色；免疫熒光

The establishment and clinical application of immunofluorescent staining method to detect mycobacterium tuberculosisYANGJiang-hua,ZHUXiao-yue,WANGWen-jie.(DepartmentofInfectiousDiseases,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method of immunofluorescence assay to detect acid-fast bacilli,and to improve the diagnostic rate of sputum-negative pulmonary tuberculosis patients.Methods57 infiltrative pulmonary tuberculosis patients were collected,and the control group was 13 patients with bacterial pneumonia．Direct sputum smear acid-fast staining or immunofluorescence assay was adapted.Results28 sputum-positive pulmonary tuberculosis patients used acid-fast staining were all positive to immunofluorescence assay.15 of 29(15/29)sputum-negative pulmonary tuberculosis patients used acid-fast staining were positive to immunofluorescence assay.13 patients with bacterial pneumonia patients were all negative to immunofluorescence assay.ConclusionImmunofluorescence assay with specificity significantly improved the diagnostic rate of sputum-negative pulmonary tuberculosis patients.

Key words:Pulmonary tuberculosis;immunofluorescence assay;acid-fast staining

(收稿日期：2014-08-15)

作者簡介：楊江華，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：感染與免疫。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R521

文章編號：1007-4287(2015)05-0775-03

基金項(xiàng)目:安徽省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目(No.09A002)與省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目( AH201310368067)