曾　彥，王　東，許晶晶，張宇清

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院 心內(nèi)科，北京100037)

?

高血壓患者體內(nèi)脯氨酸寡肽酶酶學(xué)活性的臨床研究

曾彥，王東，許晶晶，張宇清*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院 心內(nèi)科，北京100037)

摘要：目的檢測高血壓患者體內(nèi)脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)酶學(xué)活性變化并探討這一變化與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性。方法選取2012年8月1日至2014年6月1日間就診于北京阜外心血管病醫(yī)院的高血壓1級患者45例、高血壓2級患者26例，高血壓3級患者24例及正常血壓受試者27例。所有參與者均行體格及超聲心動圖檢查，并抽取靜脈血以測定POP酶學(xué)活性以及相關(guān)生化指標(biāo)。采用Pearson線性相關(guān)分析確定參數(shù)之間的變化及關(guān)系。結(jié)果與對照組相比，高血壓患者POP酶學(xué)活性減低(1級高血壓1.40±0.56 U、2級高血壓1.13±0.60 U、3級高血壓1.10±0.58 U，對比對照組1.82±0.47 U，均P<0.01)，與高血壓1級患者相比，高血壓2級和3級患者血漿中POP酶學(xué)活性減低(P<0.05)。Pearson線性相關(guān)分析提示POP酶學(xué)活性與收縮壓、舒張壓、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、左心室心肌質(zhì)量指數(shù)相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論P(yáng)OP酶學(xué)活性隨著高血壓程度的加重而減低。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0739)

腎素血管緊張素系統(tǒng)在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)作為一種能水解血管緊張素(angiotensin,Ang)Ⅰ、Ⅱ的肽酶，可以將Ang I，Ang Ⅱ分子水解，生成Ang(1-7)[1]。Ang(1-7)是近年來發(fā)現(xiàn)的血管緊張素家族成員之一，具有擴(kuò)張動脈血管、降低血壓、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用[2]。因此，POP活性的改變，可能會導(dǎo)致Ang(1-7)的生成減少，AngⅠ和AngⅡ蓄積增多，進(jìn)而導(dǎo)致高血壓的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)POP能降解多種神經(jīng)肽、激素、細(xì)胞因子，如血管緊張素、P物質(zhì)、促甲狀腺激素釋放激素、促性腺激素釋放激素等，提示其在血壓的調(diào)節(jié)以及精神障礙中起重要作用，而POP在腦中的濃度最高，引起了用其抑制劑治療認(rèn)知和精神障礙的研究熱潮[3]。但國內(nèi)外關(guān)于POP對高血壓發(fā)生發(fā)展的直接作用及其機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少，在高血壓患者中是否存在POP活性的改變值得研究和探討。本文通過檢測不同程度高血壓患者體內(nèi)POP血清學(xué)活性，并與正常血壓人群進(jìn)行比較，觀察其酶學(xué)活性的變化，探討這一變化與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究提供臨床依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對象選取2012年8月1日至2014年6月1日間就診于北京阜外心血管病醫(yī)院的高血壓病患者(高血壓組)和健康查體者(對照組)。高血壓組患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①新發(fā)現(xiàn)高血壓且未曾服用任何抗高血壓藥物患者；②均符合《中國高血壓防治指南2010》(指南)[4]關(guān)于原發(fā)性高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③男女不限，年齡35-70歲。高血壓患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合入選標(biāo)準(zhǔn)者；②合并有嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤等疾病者；③合并有器質(zhì)性心臟病者；④合并有血糖不可控制的糖尿病者。高血壓組所有入選對象按照血壓的級別分為三個(gè)亞組：1級高血壓組 [收縮壓140-159 mm Hg和(或)舒張壓90-99 mm Hg]，2級高血壓組[收縮壓160-179 mm Hg和(或)舒張壓100-109 mm Hg]和3級高血壓組[收縮壓≥180 mm Hg和(或)舒張壓≥110 mm Hg]。

對照組入選標(biāo)準(zhǔn)：健康體檢人員，年齡35-70歲，均無高血壓病史和家族史，血壓均處于正常高值范圍內(nèi)(收縮壓<140 mm Hg，舒張壓<90 mm Hg)，實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖和超聲心動圖檢查均正常。對照組最終入選27例研究對象，男性15例，女性12例，平均(50.1±7.5)歲。

1.2　方法

對所有參與者進(jìn)行體格檢查，測量身高、體重，并按照指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)測量方法測量收縮壓和舒張壓。所有參與者均經(jīng)隔夜禁食8-12 h，次日清晨抽取空腹肘靜脈自凝血7 ml，分裝兩個(gè)試管，其中4 ml送本院檢驗(yàn)科測定空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)等指標(biāo)，3 ml待其凝血后離心分離血清，于-80℃冰箱保存，用于測定POP活性。

采用GE vivid 7 彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為1-3 MHz。受檢者取左側(cè)臥位，平靜呼吸，同步連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖。應(yīng)用經(jīng)胸M 型超聲、二維超聲測量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVED)、左心室室間隔(interventricular septal thickness,IVST)及后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)；據(jù)Devereux校正公式[5]計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)；以M型超聲測量左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)；應(yīng)用脈沖多普勒測量二尖瓣血流頻譜左室舒張?jiān)缙?E)與舒張晚期的峰值流速(A)及比值(E/A)。

左心室質(zhì)量(left ventricular mass，LVM，g)：LVM=O.8×{1.04×[(LVED+IVST+LVPWT)3-LVED3]}+0.6；

LVMI(g/m2)=LVM/體表面積，體表面積=0.0061×身高+0.0128×體重-0.1529)

采用熒光分析方法測定POP活性[6]，試劑盒由瑞士Bachem公司提供。每個(gè)反應(yīng)體系包含10 μL血漿及90 μL緩沖液(50 mM Hepes，pH 7.5，250 mM NaCl；1 mM EDTA；1 mM DDT；150 μM Z-glycyl-prolyl-4-methylcoumarinyl-7-amide)，37°C孵育1 h。在340 nm紫外線激發(fā)下測定其熒光強(qiáng)度，來反應(yīng)POP的酶學(xué)活性。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1　一般資料

三組間年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組相比，高血壓患者收縮壓、舒張壓、甘油三酯、總膽固醇、LDL-C升高，HDL-C減低，體重指數(shù)及空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。與對照組相比，高血壓患者POP酶學(xué)活性較低(P<0.01)，且與高血壓1級患者相比，高血壓2級和3級患者其血漿中POP酶學(xué)活性較低(P<0.05)，高血壓3級組的POP酶學(xué)活性雖較2級組低，但組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

±s)

注：POP：脯氨酸寡肽酶；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇。與對照組相比，aP<0.01，cP<0.05；與1級高血壓組比較，bP<0.05。

2.2　各組超聲指標(biāo)

對照組和高血壓患者IVST、LVPWT、LVMI、二尖瓣口舒張晚期A峰值及E/A差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；LVED及LVEF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與1級高血壓組相比，2級和3級高血壓組IVST、LVPWT和LVMI增大，E/A減小，且有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(組間比較，均P<0.05)。高血壓3級組比2級組的IVST、LVPWT和LVMI增大，E/A減小，但組間比較無統(tǒng)計(jì)差異(組間比較，均P>0.05)，見表2。

±s)

注：IVST：左心室舒張末期室間隔厚度；LVPWT：左心室舒張末期左室后壁厚度；LVED：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVMI：左心室質(zhì)量指數(shù)；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；E：二尖瓣口舒張?jiān)缙谘鞣逯邓俣?；A：二尖瓣口舒張晚期血流峰值速度；E/A：E峰與A峰比值。與對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與1級高血壓組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.3　Pearson線性相關(guān)分析

Pearson線性相關(guān)分析提示POP酶學(xué)活性與收縮壓、舒張壓、甘油三酯、HDL-C、LVMI相關(guān)(P<0.05)，見表3。偏相關(guān)分析顯示，依次控制其他臨床指標(biāo)，如年齡、體重指數(shù)、空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、LDL-C、HDL-C以及LVMI之后，POP酶仍與收縮壓和舒張壓相關(guān)(分別r=-0.238和-0.215，均P<0.05)。

表3　 POP酶學(xué)活性與臨床指標(biāo)的Pearson相關(guān)性分析(n=122)

注：POP：脯氨酸寡肽酶；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LVMI：左心室質(zhì)量指數(shù)。

3討論

本研究通過比較正常血壓人群和新發(fā)高血壓患者血中POP酶學(xué)活性，證實(shí)高血壓患者中，POP酶學(xué)活性隨著高血壓程度的加重而水平較低。線性分析顯示，控制其他臨床指標(biāo)之后，POP酶仍與收縮壓、舒張壓相關(guān)。這些證據(jù)提示POP酶學(xué)活性的減低在高血壓發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。

腎素血管緊張素系統(tǒng)的過度激活是高血壓發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制，而POP可將Ang Ⅰ、Ang Ⅱ分子水解，生成Ang(1-7)[1,7]。POP酶是一種廣泛分布于組織中的絲氨酸內(nèi)肽酶[8]，因不能降解大分子蛋白質(zhì)被命名為脯氨酰寡肽酶。已知POP酶在腎皮質(zhì)中特別豐富，但其最初發(fā)現(xiàn)于人類子宮，它有降解催產(chǎn)素的作用，該酶對AngⅠ、AngⅡ、緩激肽和加壓素等多肽有活性作用。另有研究顯示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中POP有影響學(xué)習(xí)和記憶的功能，這些發(fā)現(xiàn)也推動了幾種高親和力特異性抑制劑的研發(fā)[9]，例如，S-1709在大鼠體內(nèi)(POP的一種高度特異的抑制劑)對POP的 Ki為1.3 nM，且對其他肽酶無抑制作用，包括氨肽酶M，二肽基肽Ⅳ，腦啡肽酶，內(nèi)肽酶3.4.24.15和3.4.24.16，鈣蛋白酶和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)。已有學(xué)者推測POP可能有調(diào)節(jié)血壓的作用[10]。有人曾建立了POP基因敲除小鼠模型，但并未報(bào)道這些小鼠的血壓值[11]。

另外，POP的催化產(chǎn)物Ang(1-7)是新近發(fā)現(xiàn)的Ang家族新成員，研究顯示，通過一氧化氮、前列腺素的介導(dǎo)，非降壓劑量的Ang(1-7)即可擴(kuò)大緩激肽的擴(kuò)血管效應(yīng)[12]；Ang(1-7)可通過局部緩激肽的作用并依賴一氧化氮的機(jī)制實(shí)現(xiàn)中樞降壓作用[13]；Ang(1-7)還可以減少Ang Ⅱ引起的血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響血管和心臟的功能[14]。因此，Ang(1-7)具有擴(kuò)張動脈血管、降低血壓、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖等特點(diǎn)。POP作為生成Ang(1-7)的主要肽酶，其活性的高低直接影響到Ang(1-7)上述功能的發(fā)揮。因此，本團(tuán)隊(duì)推測，體內(nèi)POP酶學(xué)活性的減低可能會導(dǎo)致Ang(1-7)生成的不足，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮，導(dǎo)致高血壓的發(fā)生和發(fā)展，而本研究中還發(fā)現(xiàn)血壓與POP酶活性呈負(fù)相關(guān)，更加證實(shí)了POP與高血壓發(fā)展之間的關(guān)系。

對于高血壓患者中為何存在POP酶學(xué)活性的偏低，尚未有明確的機(jī)制進(jìn)行解釋。 Cumming等[15]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激狀態(tài)可以使POP分子內(nèi)部形成二硫鍵,這使POP分子內(nèi)的β螺旋片層區(qū)域的片層之間，及β螺旋片層區(qū)域和β水解酶區(qū)域之間不能協(xié)調(diào)地相對運(yùn)動，導(dǎo)致POP的催化活性位點(diǎn)無法暴露給底物，喪失水解底物的能力，繼而表現(xiàn)為與這些底物有關(guān)的病理生理狀態(tài)改變，如血壓和心臟舒張功能的改變。本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，可能是由于高血壓患者體內(nèi)存在炎癥及氧化應(yīng)激等病理生理過程，POP分子在氧化應(yīng)激條件下，內(nèi)部二硫鍵形成，酶學(xué)活性降低。

最近的一項(xiàng)研究中，分別給野生型、C-KO(攜帶點(diǎn)突變的基因工程小鼠，其ACE的C-末端催化結(jié)構(gòu)域可被特異性滅活)和N-KO(攜帶點(diǎn)突變的基因工程小鼠，其ACE的N-末端催化結(jié)構(gòu)域可被特異性滅活)三組小鼠連續(xù)輸注AngⅡ兩周，顯示在第14天，C-KO組與野生組間的血壓值無顯著差異，而N-KO組的血壓則明顯高于其余兩組；隨后的研究中，用POP抑制劑(S-17092)對N-KO和野生型小鼠均進(jìn)行預(yù)處理后，再予等劑量的AngⅡ，發(fā)現(xiàn)經(jīng)S-17092預(yù)處理的N-KO小鼠的血壓值與野生組持平，低于未經(jīng)S-17092預(yù)處理的N-KO小鼠組；該研究還發(fā)現(xiàn)盡管N-KO組的血清AcSDKP(AcSDKP是一種小分子肽，由POP酶水解產(chǎn)生，該過程可以被S-17092抑制)水平明顯升高，但它并不是引起N-KO小鼠血壓升高的原因[16]。上述結(jié)果說明，在控制血壓過程中，POP酶和ACE的作用間可能存在一個(gè)重要平衡，但POP抑制劑的具體降壓作用機(jī)制并不清楚，認(rèn)為可能有其它POP產(chǎn)物也與ACE的N-末端相互作用。雖然該試驗(yàn)結(jié)果與本研究結(jié)果相互矛盾，實(shí)質(zhì)上均說明POP有影響血壓的作用，但是由于其作用過程復(fù)雜，可能涉及到多路徑、需多種因子的參與，其中任一環(huán)節(jié)發(fā)生改變都將不同程度地影響血壓，故其結(jié)果究竟是升壓作用還是降壓作用，還需根據(jù)具體的路徑加以分析。另有兩項(xiàng)關(guān)于脯氨酰羧基肽酶(prolylcarboxypeptidase，PRCP)的研究。PRCP又稱血管肽酶C，其作用機(jī)制是通過代謝AngⅡ、AngⅢ分別生成Ang1-7 和Ang2-7[17]，具有與POP類似的作用過程。研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦能有效降低大鼠血壓和逆轉(zhuǎn)腸系膜動脈肥厚，其作用機(jī)制可能與PRCP的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[18]。在氯沙坦對兩腎一夾高血壓大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，氯沙坦能顯著升高非手術(shù)側(cè)腎臟組織中PRCP、血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶的蛋白表達(dá)，降低TGF-β1蛋白的表達(dá)，認(rèn)為這一作用可能與其增強(qiáng)大鼠體內(nèi)PRCP-血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶調(diào)節(jié)軸功能、降低TGF-β1蛋白的表達(dá)有關(guān)[19]。綜合以上研究結(jié)果，目前，POP調(diào)控血壓的具體路徑尚不明確，需進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)加以論證。

參考文獻(xiàn)：

[1]Garcia-Horsman JA,M?nnist? PT,Ven?l?inen JI.On the role of prolyl oligopeptidase in health and disease[J].Neuropeptides,2007,41(1):1.

[2]Fyhrquist F,Saijonmaa O.Renin-angiotensin system revisited[J].J Intern Med,2008,264(3): 224.

[3]García-Horsman JA,M?nnist? PT,Ven?l?inen JI.On the role of prolyloligopeptidase in health and disease[J].Neuropeptides,2007,41(1):1.

[4]中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南2010[J].中華高血壓雜志，2011，19(8)：701.

[5]Devereux RB,Pickering TG,Alderman MH,et al.Left ventricular hypertrophy in hypertension.Prevalence and relationship to pathophysiologic variables[J].Hypertension,1987,9(2 Pt 2):1153.

[6]Goossens F,De Meester I,Vanhoof G,et al.A sensitive method for the assay of serum prolyl endopeptidase[J].Eur J Clin Chem Clin Biochem,1992,30(4):235.

[7]Greene LJ,Spadaro AC,Martins AR,et al.Brain endo-oligopeptidase B: a post-proline cleaving enzyme that inactivates angiotensin I and II[J].Hypertension,1982,4(2):178.

[8]Szeltner Z,Polgár L.Structure,function and biological relevance of prolyl oligopeptidase[J].Curr Protein Pept Sci,2008，9:96.

[9]Lawandi J,Gerber-Lemaire S,Juillerat-Jeanneret L,et al.Inhibitors of prolyl oligopeptidases for the therapy of human diseases: defining diseases and inhibitors[J].J Med Chem,2010,53:3423.

[10]Goossens F,De Meester I,Vanhoof G,et al.Distribution of prolyl oligopeptidase in human peripheral tissues and body fluids[J].Eur J Clin Chem Clin Biochem,1996,34:17.

[11]Di Daniel E,Glover CP,Grot E,et al.Prolyl oligopeptidase binds to GAP-43 and functions without its peptidase activity[J].Mol Cell Neurosci，2009，41:373.

[12]Paula RD,Lima CV,Khosla MC,et al.Angiotensin-(1-7) potentiates the hypotensive effect of bradykinin in conscious rats[J].Hypertension,1995,26 (6 Pt 2):1154.

[13]Gironacci MM,Vatta M,Rodriguez-Fermepín M,et al.Angiotensin-(1-7) reduces norepinephrine release through a nitric oxide mechanism in rat hypothalamus[J].Hypertension,2000,35(6):1248.

[14]Tallant EA,Diz DI,Ferrario CM.State-of-the-Art lecture.Antiproliferative actions of angiotensin-(1-7) in vascular smooth muscle[J].Hypertension,1999,34(4 Pt 2):950.

[15]Cumming RC,Andon NL,Haynes PA,et al.Protein disulfide bond formation in the cytoplasm during oxidative stress[J].J Biol Chem,2004,279(21):21749.

[16]Frank SO,Chentao XL,Duncan JC,et al.Increased angiotensin II-induced hypertension and inflammatory cytokines in mice lacking angiotensin-converting enzyme N domain activity[J].Hypertension，2012,59(2):283.

[17]Odya CE，Marinkovic DV，Hammon KJ，et al.Purification and properties of prolylcarboxypeptidase(angiotensinase C)from human kidney[J].J Biol Chem，1978，253(17)：5 927.

[18]李湘宏，秦又發(fā)，陳根，等.脯氨酰羧基肽酶介導(dǎo)氯沙坦對高血壓模型大鼠血管重構(gòu)的抑制作用研究[J].中國藥房，2013，24(13)：1168.

[19]秦又發(fā)，田海紅， 孫飛，等.氯沙坦對兩腎一夾高血壓大鼠腎臟的保護(hù)作用及PRCP-激肽釋放酶調(diào)節(jié)軸的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(1)：59.

關(guān)鍵詞：高血壓；脯氨酸寡肽酶；血管緊張素；超聲心動圖

Evaluation of prolyl oligopeptidase enzymatic activity in hypertensive patientsZENGYan,WANGDong,XUJing-jing,etal.(CardiologyDepartment，F(xiàn)uwaiHospital，NationalCenterforCardiovascularDiseases，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100037，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the enzymatic activity of prolyl oligopeptidase (POP) in hypertensive patients and explore the relations between the changes of POP enzymatic activity and clinical features.MethodsForty-five patients with grade 1 hypertension,26 patients with grade 2 hypertension，24 patients with grade 3 hypertension and 27 normotensives were included in the present study,who were selected from Fuwai Hospital from 1st August,2012 to 1st June,2014.All the participants underwent physical and echocardiographic examinations.Meanwhile,fasting blood was collected to determine the POP enzymatic activity and routine biochemical indicators.ResultsCompared with the controls,POP enzymatic activities were significantly reduced in hypertensive patients (grade 1 hypertention 1.40±0.56 U，grade 2 hypertention 1.13±0.60 U，grade 3 hypertention 1.10±0.58 U vs the controls 1.82±0.47 U，allP<0.01),and this reduction was more evident in patients with grade 2 or 3 hypertention as compared to ones with grade 1 hypertention(P<0.05).Pearson correlation analysis showed that POP enzymatic activity was significantly associated with systolic blood pressure,diastolic blood pressure,triglyceride,high density lipoproteins and left ventricular mass index(P<0.05).ConclusionPOP enzymatic activity was reduced with the increasing blood pressure.

Key words:Hypertension;Prolyl oligopeptidase;Angiotensin;Echocardiography

(收稿日期：2014-10-05)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R544.1

文章編號：1007-4287(2015)05-0739-05

*通訊作者