池細俤，高世華，陳家龍，李國玉，林蓉金

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 檢驗科，福建 南平353000)

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多藥耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因與其耐藥表型關(guān)系的分析

池細俤，高世華，陳家龍，李國玉，林蓉金

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 檢驗科，福建 南平353000)

摘要：目的研究多藥耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)的耐藥機制，為臨床有效治療該菌感染提供依據(jù)。方法應(yīng)用PCR技術(shù)對94株MDRAB進行耐藥基因檢測，比較8種耐藥基因陽性組與陰性組菌株的耐藥性。結(jié)果耐藥基因檢出率：VIM 35.1%、SIM 55.0%、TEM 59.6%、OXA-23 93.6%、OXA-24 52.1%、SHV 52.1%、PER-1 83.0%、IMP 2.1%；僅IPM、MEM、SAM在OXA-23 基因陽性組與陰性組間，和SAM 在SIM 基因陽性組與陰性組間的耐藥性有顯著差異。結(jié)論MDRAB耐藥基因檢測不能代替常規(guī)藥敏試驗，無法預(yù)測臨床治療效果；MH、PO 仍為治療MDRAB的較好選擇。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0735)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii AB)是醫(yī)院內(nèi)感染的最常見病原菌之一，多藥耐藥鮑曼不動桿菌(Multi-drug resistance Acinetobacter baumannii MDRAB)導(dǎo)致的感染更是臨床面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。為探索MDRAB耐藥性特征和其產(chǎn)生規(guī)律，本文對94株臨床MDRAB菌株進行耐藥基因、耐藥性檢測，并對兩者關(guān)系進行分析。

1對象與方法

1.1對象某綜合性三甲醫(yī)院2013年1月-2013年12月感染患者的94MDRAB菌株(每個病例只統(tǒng)計一次)；MDRAB是指對常用的7類抗假單胞菌的抗生素(包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、碳青霉烯類、四環(huán)素類、磺胺類)中的至少3類耐藥的菌株[1]。

1.2細菌培養(yǎng)、鑒定按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版培養(yǎng)分離菌種；菌種鑒定用VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌株鑒定。

1.3藥敏試驗及結(jié)果判定藥敏紙片購自O(shè)XOID公司，M-H培養(yǎng)基和多粘菌素B的Etest試條購自Biomerieux SA 公司，質(zhì)控菌株為ATCC 25923、ATCC 27853、ATCC 25922，采用CLSI2013版(M100-S23)標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.4　耐藥基因檢測

1.4.1DNA模板提取挑一個純培養(yǎng)菌落置入0.5 ml 螺口離心管內(nèi)(內(nèi)預(yù)置滅菌純水200 ul)，100℃水浴10 min ,15000 r/min 離心1 min。上清液即為基因檢測的模板,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2靶基因引物序列本研究按Ambler分類法[2]選取ESBLs類(屬A 類) TEM 型、SHV 型、SIM 型、PER-1型基因；金屬酶類(屬B 類) IMP 和 VIM 基因；OXA 酶類(屬D 類)OXA-23型、OXA-24型基因。相應(yīng)的靶基因引物序列選擇參考王玉平,董方等的實驗成果[3，4]由上海生工合成,見表1。

表1　耐藥基因引物序列

1.4.3PCR檢測和耐藥基因分析DNA擴增盒采用Long and Accurate Pcr Kit 由上海生工提供。PCR擴增體系：10×Buffer 5 μl、dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μl、P1 引物 (10 μmol/L) 0.5 μl、P2 引物 (10 μmol/L) 0.5 μl、Long and Accurate Enzyme 0.25 μl、加水到 45 μl，模板5 μl。PCR 擴增參數(shù)：93℃預(yù)變性2 min；然后93℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，35循環(huán)最后一個周期時72℃延長至5 min，在PE9600擴增儀上進行。耐藥基因分析：擴增產(chǎn)物在1.6%瓊脂糖凝膠(0.5×TBE配制，含0.5 μg/ml EB)中電泳，電泳液：0.5×TBE，調(diào)整電泳電壓到1-5V/CM電泳15 min左右，在上海天能紫外凝膠電泳成像儀下觀察，在相應(yīng)的分子量處出現(xiàn)高亮的條帶為陽性。

1.5統(tǒng)計分析方法采用SPSS 17.0軟件進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.194株MDRAB藥敏試驗結(jié)果見表2。

表2　94 株MDRAB藥敏試驗結(jié)果[n(%)]

* P0選用Etest方法測MIC，94株MDRAB對PO的MIC在0.38-1 ng/ml之間。

2.2MDRAB耐藥基因擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳成像見圖1。

注：PER-1 型耐藥基因產(chǎn)物,分子量約923；標(biāo)本34-42、44為陽性；標(biāo)本43、45-49為陰性。

圖1耐藥基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳成像結(jié)果

2.3耐藥基因分析94株MDRAB耐藥基因陽性率 VIM 35.1%；SIM 55.0%；TEM 59.6%；OXA-23 93.6%；OXA-24 52.1%；SHV 52.1%；PER-1 83.0%；IMP 2.1%。同時攜帶多種耐藥基因的情況：2種4.3%、3種19.1%、4種30.9%、5種30.9%、6種9.6%、7種4.3%。

2.4　將94株MDRAB以是否檢出耐藥基因進行分組，比較兩組耐藥性差異

2.4.1以是否檢出ESBLs基因進行分組Per-1基因陽性菌株78株、陰性16株；SHV 基因陽性菌株49株、陰性45株；TEM 基因陽性菌株56株、陰性38株；SIM 基因陽性菌株52株、陰性42株，兩組耐藥性比較見表3。

表3　ESBLs基因陽性與陰性菌株耐藥性比較(n/n)

2.4.2以是否檢出OXA 酶基因進行分組OXA-24 基因陽性菌株49株、陰性45株；OXA-23 基因陽性菌株88株、陰性6株，兩組耐藥性比較見表4。

表4　OXA 酶基因陽性菌株與陰性菌株耐藥性比較(n/n)

2.4.3以是否檢出金屬酶基因進行分組VIM 基因陽性菌株33株、陰性61株；IMP基因陽性菌株2株、陰性92株，兩組耐藥性比較見表5。

2.5耐藥基因陽性菌株對常用抗菌藥物的耐藥率與94株MDRAB總耐藥率比較，耐藥基因陽性菌株數(shù)n：PER-1=78；SHV=49；TEM=56；SIM=52；OXA-24=49；OXA-23=88；VIM=33；IMP=2,比較結(jié)果見表6。

表5　金屬酶基因陽性菌株與陰性菌株耐藥性比較(n/n)

3討論

近年來，由于新抗菌藥物大量使用形成的選擇性壓力增加了MDRAB的感染機會，抵抗力弱或有創(chuàng)傷的患者可從醫(yī)務(wù)人員的手或消毒不徹底的醫(yī)療器械獲得感染，易發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)[5]，如何及時有效治療MDRAB感染患者，已成為臨床醫(yī)療和院感管理的重要課題。

多粘菌素B(PO)為分離自多粘類芽孢桿菌的脂肽類抗菌藥物，它與革蘭陰性菌外膜的脂多糖互相作用,并通過細菌“自發(fā)攝取”通路攝取，使細胞內(nèi)的重要物質(zhì)外漏而起殺菌作用，為快速殺菌劑，本研究的94株MDRAB對PO 高度敏感，MIC在0.38-1 ng/ml之間，因此在監(jiān)控腎毒性和神經(jīng)毒性的前提下，PO可以作為治療MDRAB、PDRAB等泛耐藥革蘭陰性桿菌感染的可選方案[6,7]。

米諾雙環(huán)(MH)的耐藥率較低(7.4%)，低于褚少朋等報道，與俞汝佳等報道的耐藥率接近[8，9]，鹽酸米諾環(huán)素(Minocyclinehydrochloride)，系第二代四環(huán)素類抗生素，具有高效、長效、低毒的特性，是目前四環(huán)素類中抗菌作用較強的藥物。本研究也未發(fā)現(xiàn)耐藥基因陽性的菌株出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象，MH 及替加環(huán)素仍可做為臨床治療MDRAB的重要抗菌藥物。

MDRAB的耐藥基因除亞安培南(IMP) 陽性率為2.1%較低外，其他VIM 35.1%；SIM 55.0%；TEM 59.6%；OXA-23 93.6%；OXA-24 52.1%；SHV 52.1%；PER-1 83.0%攜帶率較為嚴(yán)重；且同時攜帶多種耐藥基因的情況也較普遍：攜帶2種4.3%、3種19.1%、4種高達30.9%、5種高達30.9%、6種9.6%、7種4.3%。耐藥譜顯示β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，如CAZ、FEP、TIM 等耐藥率高達98.9%-100%；碳青霉烯類抗生素IPM、MEM 等耐藥率也高達98.9%?？紤]為在抗生素壓力下，MDRAB同時攜帶多種耐藥基因產(chǎn)生的多種耐藥機制交叉或共同作用所致。但SCF 的耐藥率58.5%，中介率38.3%，相對其他三、四代頭孢如CAZ、FEP 及碳青霉烯類抗生素IPM、MEM 較輕，提示在治療MDRAB感染時舒巴坦與頭孢哌酮有一定的協(xié)同效果，與周光、徐小用等報道一致[10，11]。氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類耐藥率均高達94.7%～100%，這也與MDRAB同時攜帶多種耐藥基因交叉作用有關(guān)。

分組比較ESBLs、OXA 酶、金屬酶基因耐藥基因陽性組和陰性組MDRAB的耐藥性，除IPM、MEM、SAM在OXA-23 基因陽性組與陰性組間，和SAM 在SIM 基因陽性組與陰性組間的耐藥性有顯著差異外，其他耐藥基因陽性組與陰性組的耐藥譜相差均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，耐藥基因陽性組、陰性組耐藥率與總耐藥率比較也較一致，提示MDRAB耐藥基因檢測不能代替常規(guī)藥敏試驗，未檢出某耐藥基因的MDRAB菌株其相應(yīng)的抗菌藥物亦可能耐藥，無法預(yù)測臨床治療效果。

參考文獻：

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關(guān)鍵詞：鮑曼不動桿菌；多藥耐藥；基因型；耐藥性

A Study of the Relationship between the Drug-resistant Gene of Multidrug ResistanceAcinetobacterBaumanniiand its Drug-resistant PhenotypeCHIXi-di,GAOShi-hua,CHENJia-long,etal.(DepartmentofLabMed,TheAffiliatedFirstHospitalofNanping,FujianMedicalUniversity,Nanping353000,China)

Abstract:Objective OBJECTIVE To investigate the drug-resistant mechanism of Multi-drugAcinetobacterBaumannii(MDRAB),thus providing a theoretical basis for the effective treatment of MDRAB in clinical.MethodsDrug-resistant gene sequencings for 94 MDRAB were made by Polymerase Chain Reaction (PCR).Drug resistances were contrasted between positive group and the negative group of 8 drug resistance genes of MDRAB.ResultsThe detection rates of 8 drug resistance genes were VIM 35.1%,SIM 55.0%,TEM 59.6%,OXA-23 93.6%,OXA-24 52.1%,SHV 52.1%,PER-1 83.0%,IMP 2.1%.Drug resistance of Imipenem (IPM)，meropenem (MEM)，Ampicillin/Sulbactam (SAM) were only found to be significantly different between the positive group and negative group of OXA-23 gene.And drug resistance of SAM was only found to be significantly different between the positive group and negative group of SIM gene.ConclusionThis study revealed that drug-resistant gene sequencing of MDRAB could not replace the normal drug susceptibility testing,for its unpredictable clinical therapeutic effect.Besides,Minocycline (MH) and Polymyxin B (PO) were still the better treatment in MDRAB.

Key words:Acinetobacterbaumannii；Multidrug-resistant；Genotype ；Drugresistance

(收稿日期：2014-12-11)

作者簡介：池細俤，男，44歲，副主任技師，檢驗科主任，研究方向：臨床微生物檢驗及分子生物學(xué)檢驗。

文獻標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R378

文章編號：1007-4287(2015)05-0735-05

基金項目：福建省南平市科技計劃項目資助 N2011Z15(1)