張清健，鄭立新，田佩玲，葉嘉玲，楊　衛(wèi)，王柏賢，徐珊珊，周冰燚，蔡慧娜，方俊宇，朱志勇

(廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 生殖科，廣東 廣州510600)

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短串聯(lián)重復(fù)序列連鎖分析進(jìn)行產(chǎn)前診斷前母血污染鑒定的研究

張清健*，鄭立新，田佩玲，葉嘉玲，楊衛(wèi)，王柏賢，徐珊珊，周冰燚，蔡慧娜，方俊宇，朱志勇

(廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 生殖科，廣東 廣州510600)

摘要：目的建立一種簡(jiǎn)單易行，快速，準(zhǔn)確的母血污染鑒定技術(shù)，應(yīng)用于產(chǎn)前診斷前排除母血污染。方法在X染色體上選取具有高雜合度和高多態(tài)性的6個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)，應(yīng)用連鎖分析對(duì)10例羊水和10例臍帶血標(biāo)本進(jìn)行母血污染鑒定。結(jié)果在10例羊水和10例臍帶血標(biāo)本中各發(fā)現(xiàn)1例標(biāo)本發(fā)生母血污染。結(jié)論該方法可應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行產(chǎn)前診斷前排除母血污染。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0728)

臨床上，用于遺傳病產(chǎn)前診斷的羊水和臍帶血標(biāo)本，有時(shí)會(huì)在穿刺過(guò)程中受到母血的污染，可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的產(chǎn)前診斷結(jié)果而引起醫(yī)療糾紛。我們?cè)赬染色體上選取具有高雜合度和高多態(tài)性的6個(gè)位點(diǎn)(見表1)作為個(gè)體識(shí)別標(biāo)志,采用多重PCR結(jié)合銀染檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)前診斷前羊水和臍血是否存在母血污染，旨在建立一種簡(jiǎn)單易行、快速、準(zhǔn)確的母血污染鑒定方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1　對(duì)象

20例個(gè)體均遵照知情同意原則，采集其靜脈血和羊水或臍帶血標(biāo)本。

1.2　方法

1.2.1雙盲法處理標(biāo)本收集標(biāo)本的人員，用母血人為污染若干例羊水或臍血標(biāo)本；而實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和分析人員并不知情。

1.2.2外周血、羊水細(xì)胞和臍血DNA的提取采用常規(guī)苯酚抽提法提取外周血DNA。

1.2.3PCR擴(kuò)增在95℃3 min，95℃ 40 s，于相應(yīng)的Tm進(jìn)行退火35 s，72℃延伸35 s(時(shí)間可根據(jù)片段大小進(jìn)行調(diào)整，具體引物序列及Tm值見表2)，30-33個(gè)循環(huán)，72℃總延伸8 min，4℃保存。變性聚丙烯酰胺凝膠電脈，銀染法檢測(cè)。

表1　6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)詳細(xì)情況

注：雜合度：表示在人群中，該等位基因位點(diǎn)為雜合的概率。雜合度高的位點(diǎn)有利于單體型分析，信息含量高。

表2　6個(gè)位點(diǎn)引物序列

2結(jié)果

2.1在10例臍血之母血污染檢測(cè)圖1所示3號(hào)臍血標(biāo)本，從44CA、45CA和63CA明顯可排出母血污染。圖2所示6號(hào)發(fā)生污染，其余9例未發(fā)現(xiàn)母血污染，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1　3號(hào)臍血標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果，從44CA、45CA和63CA明顯可排出母血污染

圖2　從6個(gè)位點(diǎn)上可判斷6號(hào)臍血標(biāo)本發(fā)生了母血污染

2.2在10例羊水之母血污染檢測(cè)10號(hào)發(fā)現(xiàn)存在母血污染，其余9例未發(fā)現(xiàn)母血污染；與預(yù)期結(jié)果相符(圖3、圖4)。

圖3　9號(hào)羊水標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果，從44CA、45 CA和49 CA可明顯排除母血污染

圖4　從6個(gè)位點(diǎn)上可判斷10號(hào)羊水標(biāo)本發(fā)生了母血污染

3討論

Kleihaure抗酸染色法是鑒別母血與胎血的傳統(tǒng)技術(shù)。此技術(shù)原理是有核紅細(xì)胞中胎兒血紅蛋白與成人血紅蛋白之間結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致胎兒血紅蛋白比成人血紅蛋白更能抵抗酸變性[1]。Kleihaure抗酸染色法廣泛應(yīng)用于母嬰溶血、妊娠期間外傷及陰道出血等臨床檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，成本低廉；缺點(diǎn)是如果母體血液中HBF含量的異常升高(如鐮狀細(xì)胞病或部分β地中海貧血病)，染色過(guò)程中就會(huì)出現(xiàn)將母血誤為胎兒血的錯(cuò)誤結(jié)果。例如，在18例用Kleihaure抗酸染色技術(shù)鑒定實(shí)驗(yàn)中，Holcomb WL[2]等發(fā)現(xiàn)至少有2例將母血錯(cuò)誤地鑒定為胎兒血。

流式細(xì)胞術(shù)是70年代初發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，其工作原理是采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。流式細(xì)胞儀比Kleihaure抗酸染色法快速、靈敏和特異[3]；缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴，還要制備各種昂貴的抗體進(jìn)行熒光染色，操作過(guò)程繁瑣且技術(shù)要求高，因而難以普及。

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)位點(diǎn)是人類基因組DNA中廣泛存在的一類具有高度多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性的遺傳標(biāo)記。它是由2-6個(gè)堿基對(duì)組成的核心序列,經(jīng)過(guò)幾次到幾十次串聯(lián)重復(fù),構(gòu)成特定的DNA片段遺傳標(biāo)記，每個(gè)個(gè)體同一等位基因上這種系列重復(fù)次數(shù)不同，呈多態(tài)性并按孟德爾規(guī)律呈共顯性遺傳[4]。

在短串聯(lián)重復(fù)序列中，小的變異幾乎潛伏著無(wú)限等位基因的變異，鑒定這些變異，甚至在單個(gè)座位的基因型足可以鑒定一個(gè)個(gè)體，如有4個(gè)以上位點(diǎn)不排斥假設(shè)父親時(shí)，一般父親關(guān)系概率均在99.7%以上[5]，因而選取幾個(gè)位點(diǎn)可作為一有效個(gè)體識(shí)別標(biāo)志，具有極強(qiáng)的特異性；另外結(jié)合PCR技術(shù)，使得此技術(shù)具有極強(qiáng)的靈敏度，理論上羊水或臍帶血標(biāo)本只要含有一個(gè)母體有核細(xì)胞，就可以得到鑒別。我們選取具有高雜合度和高多態(tài)性的6個(gè)STR位點(diǎn),應(yīng)用多重PCR結(jié)合銀染對(duì)10例羊水和10例臍血標(biāo)本進(jìn)行母血污染鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致，準(zhǔn)確可靠。此技術(shù)還具有操作簡(jiǎn)單，所需設(shè)備簡(jiǎn)便，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。適宜在普通醫(yī)院進(jìn)行推廣，具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

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[4]Edwards AL,Civitello A.DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats[J].Am J Hum Genet,1991,49(4):746.

[5]周新,孫連名,吳健民，等.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)考核指南[M].第2版.武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2004:386.

關(guān)鍵詞：連鎖分析；產(chǎn)前診斷；母血污染

Identification of maternal blood contamination before prenatal diagnosis with short tandem repeat sequences linkage analysisZHANGQing-jian,ZHENGLi-xin,TIANPei-ling,etal.(FamilyPlanningResearchInstituteofGuangDongProvince,Guangzhou510600，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a simple,rapid,accurate maternal blood contamination identification technology,used to exclude maternal blood contamination before prenatal diagnosis.Methods6 short tandem repeat loci on the X chromosome with high heterozygosity and polymorphism were selected to identify maternal blood contamination from 10 cases of amniotic fluid and 10 cases of umbilical cord blood specimens by linkageanalysis.ResultsIn 20 cases of samples,one case of amniotic fluid and one case of umbilical cord blood samples occurred in maternal blood contamination,respectively.And the experiment results agree with expected results.ConclusionThis method can be used to exclude maternal blood contamination before prenatal diagnosis in clinical laboratories.

Key words:linkage analysis;prenatal diagnosis;maternal blood contamination

(收稿日期：2014-12-16)

作者簡(jiǎn)介：張清健(1977-)，男，副主任技師，碩士，研究方向：生殖遺傳學(xué)。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R714

文章編號(hào)：1007-4287(2015)05-0728-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：廣東省計(jì)生委項(xiàng)目(編號(hào)：2009202)