蘇國娟，王國慶

(1.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院 檢驗科，河北 唐山063300；2.天津市口腔醫(yī)院 檢驗科，天津300041)

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陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌AmpC酶和ESBLs的檢測及其耐藥性研究

蘇國娟1*，王國慶2

(1.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院 檢驗科，河北 唐山063300；2.天津市口腔醫(yī)院 檢驗科，天津300041)

摘要：目的了解本地區(qū)陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌AmpC酶和ESBLs的流行分布及對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況，為臨床合理用藥提供依據(jù)。方法陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌的鑒定及藥敏使用西門子MicroScan WALKAWAY96全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行，采用酶提取物三維試驗方法檢測AmpC酶，使用表型確證試驗紙片擴散法測定ESBLs。結果76株陰溝腸桿菌中，產(chǎn)AmpC酶菌株為15株(19.74%)，產(chǎn)ESBLs菌株為24株(31.58%)，同時產(chǎn)兩種酶的菌株為11株(14.47%)。43株奇異變形桿菌中，產(chǎn)AmpC酶菌株為7株(16.28%)，產(chǎn)ESBLs菌株為18株(41.86%)，同時產(chǎn)兩種酶的菌株為6株(13.95%)。對其藥敏結果分析顯示產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的菌株耐藥性明顯高于不產(chǎn)酶菌株。結論產(chǎn)AmpC酶和ESBLs是陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌產(chǎn)生耐藥的重要機制，碳青霉烯類藥物是治療這兩種細菌感染的首選藥物。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0719)

陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌是環(huán)境中常見的腸桿菌科細菌，近年來已經(jīng)成為重要的院內感染的病原菌。隨著三、四代頭孢菌素的大量廣泛使用，這兩種細菌的耐藥性不斷增加，其中產(chǎn)AmpC酶和超廣譜β-內酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)是最主要的耐藥機制，給臨床抗感染治療帶來很大困難。本研究通過檢測本地區(qū)臨床分離的陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs情況并對其耐藥情況進行分析，為正確掌握細菌耐藥的發(fā)展趨勢、臨床合理使用抗菌藥物及延緩和控制細菌耐藥基因的播散提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株來源菌株為2013年唐山市工人醫(yī)院和豐南區(qū)醫(yī)院臨床標本中分離鑒定的76株陰溝腸桿菌和43株奇異變形桿菌，同一患者無重復菌株。陰溝腸桿菌029 M作為產(chǎn)AmpC酶陽性對照質控菌株、肺炎克雷伯菌ATCC 700603作為產(chǎn)ESBLs陽性對照質控菌株、大腸埃希菌ATCC 25922作為不產(chǎn)AmpC酶和ESBLs兩種酶的陰性對照質控菌株。

1.2培養(yǎng)基、藥敏紙片及試劑血平板、MAC平板、M-H瓊脂平板、胰大豆蛋白胨為天津金章公司生產(chǎn)。頭孢他啶(CAZ，30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA，30/10 μg)、頭孢噻肟(CTX，30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA，30/10 μg)藥敏紙片為Oxoid公司生產(chǎn)。

1.3鑒定和藥敏菌株鑒定及藥敏試驗使用MicroScan WALKAWAY 96全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。

1.4AmpC酶的檢測采用酶提取物三維試驗方法檢測AmpC酶。按Coudron PE等[1]方法并加以改進。將疑產(chǎn)AmpC酶的菌株轉種到胰酶大豆消化液中，然后把對數(shù)生長期的細菌培養(yǎng)物離心，取沉淀部分反復凍融(-70℃及37℃水浴交替) 5次制備酶的粗提物。將30 μg的頭孢西丁紙片放置在均勻涂布0.5麥氏單位大腸埃希菌ATCC25922的M-H瓊脂平板中央，使用無菌刀片在距頭孢西丁紙片邊沿5 mm處開始向外呈放射狀地挖一約20 mm×2 mm的狹縫，將待測菌株的酶粗提物加入細槽中，置35℃孵育箱培養(yǎng)過夜。若在狹縫與頭孢西丁的抑菌環(huán)之間出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)域，即為AmpC酶陽性。

1.5ESBLs的檢測依據(jù)CLSI 推薦的表型確證試驗紙片擴散法測定ESBLs。采用頭孢他啶(30 μg)及頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)組合、頭孢噻肟(30 μg)及頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)組合。頭孢他啶和頭孢噻肟2個藥物中任何一個，在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比，增大值≥5 mm,判定為產(chǎn)ESBLs陽性。肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922分別作為ESBLs檢測的陽性和陰性質控對照菌株。

2結果

2.1AmpC酶和ESBLs檢出率76株陰溝腸桿菌中，產(chǎn)AmpC酶菌株為15株(19.74%)，產(chǎn)ESBLs菌株為24株(31.58%)，同時產(chǎn)兩種酶的菌株為11株(14.47%)，均不產(chǎn)兩種酶的菌株為26株(34.21%)。43株奇異變形桿菌中，產(chǎn)AmpC酶菌株為7株(16.28%)，產(chǎn)ESBLs菌株為18株(41.86%)，同時產(chǎn)兩種酶的菌株為6株(13.95%)，均不產(chǎn)兩種酶的菌株為12株(27.91%)。

2.276株陰溝腸桿菌對14種抗菌藥物耐藥率見表1。

表1　76株陰溝腸桿菌對14種抗菌藥物耐藥率情況(%)

2.343株奇異變形桿菌對14種抗菌藥物耐藥率見表2。

3討論

陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，是人體的正常菌群，也是很常見的條件致病菌，隨著侵入性診斷及治療操作的增加，其已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要病原菌，因此，分析其產(chǎn)酶及耐藥情況對有效控制感染、合理使用抗菌藥物及有效控制細菌耐藥基因的播散具有重要意義。陰溝腸桿菌以及奇異變形桿菌耐藥情況嚴重，給臨床治療治療帶來很大困難，而產(chǎn)AmpC 酶和產(chǎn)ESBLs是其對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的兩個主要機制。

表2　43株奇異變形桿菌對14種抗菌藥物耐藥率情況(%)

ESBLs屬Bush分類中的2 be類酶，ESBLs的產(chǎn)生，可使細菌對青霉素類、頭孢菌素和氨曲南在內的大多數(shù)β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，但對頭霉素、碳青霉烯類及酶抑制劑復方制劑敏感[2]。本研究顯示，76株陰溝腸桿菌中，產(chǎn)ESBLs菌株為24株(31.58%)，高于其他地區(qū)[3-6]。43株奇異變形桿菌中，產(chǎn)ESBLs菌株為18株(41.86%)，高于石蘭峰、徐傳和、朱巧玲、彭健新、盧雪明等[6-10]的報道及全國平均水平[2]，但低于周強等[5]的報道。此外，本研究中產(chǎn)ESBLs菌株對多種抗菌藥物的耐藥率，顯著高于非產(chǎn)ESBLs菌株。這可能與其易于在菌屬間傳遞的質粒介導耐藥決定簇有關，由于攜帶編碼ESBLs質粒的菌株，往往同時攜帶氨基糖苷類等抗菌藥物的耐藥基因，從而使產(chǎn)ESBLs菌株，呈現(xiàn)多重耐藥[11，12]。

AmpC酶又稱頭孢菌素酶，是染色體或質粒介導的β-內酰胺酶，屬于分子分類法的C類和功能分類法的Ⅰ組酶，具有比產(chǎn)ESBLs更廣的水解底物譜，因其具有較快的傳播速度和較強的耐藥性，故耐藥情況更為復雜[13]，但其可被四代頭孢、碳青霉烯類抑制。AmpC酶可以水解青霉素類抗菌藥物、第1-3代頭孢菌素類、頭霉素類和單環(huán)酰胺類，且不受克拉維酸、舒巴坦等酶抑制劑的抑制，這為臨床感染治療提出很大難題[2]。本研究顯示，76株陰溝腸桿菌中，產(chǎn)AmpC酶菌株為15株(19.74%)，高于陸丹倩等[3]的報道，低于周強、彭健新、趙德軍等[4-6]的報道。43株奇異變形桿菌中，產(chǎn)AmpC酶菌株為7株(16.28%)，高于石蘭峰、徐傳和、朱巧玲、彭健新、盧雪明等[6-10]的報道。AmpC酶菌株通常同時攜帶有其他種類抗菌藥物的耐藥基因，包括氨基糖甙類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類以及四環(huán)素等藥物的耐藥基因，故而表現(xiàn)為對青霉素類、第1-3代頭孢菌素、頭霉素類、單環(huán)類及酶抑制劑(如舒巴坦、克拉維酸、三唑巴坦)復合物均耐藥，其往往還對氨基甙類、磺胺類、氯霉素類和四環(huán)素類等抗菌藥物耐藥[14]。

總之，陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌常常呈現(xiàn)多重耐藥，給臨床治療治療帶來了極大的困難。及時、準確的針對可能的醫(yī)院感染病原菌進行檢測及監(jiān)測其耐藥性變化，并根據(jù)藥敏結果合理使用抗菌藥物，同時加強消毒隔離措施以減少交叉感染，這樣能夠有效控制醫(yī)院感染、預防耐藥菌的產(chǎn)生及傳播。

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關鍵詞：陰溝腸桿菌；奇異變形桿菌；AmpC酶；ESBLs；耐藥性

Detection of ESBLs and AmpC β-lactamase producingEnterobactercloacaeandProteusmirabilisand analysis of drug resistanceSUGuo-juan,WANGGuo-qing.(FengnanPeople＇sHospitalofTangshan,Tangshan063300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the production of AmpC enzyme and ESBLs in Gram-negative bacilli and their drug-resistance to provide basis for reasonable use of antibiotics in clinical practice.MethodsIdentification and drug susceptibility ofEnterobactercloacaeandProteusmirabiliswere performed by Siemens MicroScan WALKAWAY 96.AmpC and ESBLs were determined by three dimensional test and a phenotypic confirmatory test respectively.ResultsAmong 76Enterobactercloacaestrains,15(19.74%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase,24(31.58%) of them were detected to produce ESBLs,11 (14.47%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase and ESBLs.Among 43Proteusmirabilisstrains,7(16.28%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase,18(41.86%) of them were detected to produce ESBLs,6 (13.95%) of them were detected to produce AmpC β-lactamase and ESBLs.The drug susceptibility testing result indicated that the drug resistance rate of enzyme-producing strains was higher than that of the non-enzyme-producing strains.ConclusionAmpC β-lactamase and ESBLs have been a critical cause of the drug-resistance inEnterobactercloacaeandProteusmirabilis.Carbapenems can be the first choice to treatEnterobactercloacaeandProteusmirabilisinfections.

Key words:Enterobactercloacael;Proteusmirabilis;AmpC β-lactamase;ESBLs;Drug resistance

(收稿日期：2014-10-11)

作者簡介：蘇國娟(1973-)，女，副主任技師，主要研究方向為臨床微生物學。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R378.2

文章編號：1007-4287(2015)05-0719-04

*通訊作者

基金項目：天津市衛(wèi)生局科技基金(2013ky23)