陳　強(qiáng)，徐　洋

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔頜面外科，吉林 長春130021)

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單胺氧化酶B在大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)中的定位

陳強(qiáng)，徐洋*

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔頜面外科，吉林 長春130021)

摘要：目的研究單胺氧化酶B(MAOB)在大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究MAOB與外周神經(jīng)系統(tǒng)中軸突運(yùn)輸和神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)系提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法采用免疫組織化學(xué)的方法，通過光鏡和電鏡觀察MAOB在大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)中的分布。結(jié)果光鏡下，MAOB免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞分布在舌體的上皮及固有層中。電鏡下，MAOB免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞分布在大鼠舌體有髓鞘和無髓鞘軸突中。陽性物質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)中，準(zhǔn)確來說為線粒體外膜上。結(jié)論MAOB在大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)軸突的表達(dá)，提示MAOB可能與軸突的運(yùn)輸和神經(jīng)傳導(dǎo)有著非常重要的作用。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0713)

單胺氧化酶(MAO)是一種降解生物肽的酶[1]，分為兩種亞型，單胺氧化酶A(MAOA)和單胺氧化酶B(MAOB)[2]。MAO-A對底物血清素(5-HT)、去甲腎上腺素 (NE)、多巴胺(DA)和抑制劑氯吉蘭具有高度親和性[3]；單胺氧化酶B是一種線粒體黃素蛋白酶，其作用主要為氧化脫氨，對苯乙基胺(PEA)、苯甲胺和抑制劑司來吉蘭(deprenyl)具有高親和性[4]。MAOB主要傾向于外源性胺的新陳代謝，如2-苯基乙胺，故其對酶作用物苯基乙胺以及抑制物司來吉蘭有密切關(guān)系。因此，它可以作為大腦代謝屏障限制假神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]。另外，MAOB還可以代謝大腦中的多巴胺，其抑制劑通常被用來治療帕金森病[6,7]。之前研究證實(shí)，MAOB不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周組織中，如肝臟、腎臟、腦、甲狀腺等[8,9]。但MAOB主要存在于淋巴細(xì)胞和血小板中。

目前MAOB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官的分布已經(jīng)研究到了細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平，在外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞及亞細(xì)胞的研究較少。在我們的研究中，通過免疫組化的方法確定大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)MAOB存在，從而進(jìn)一步探索MAOB與外周神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系。

1材料與方法

1.1　動(dòng)物

清潔級正常健康雄性SD大鼠6只，體重180-200 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有實(shí)驗(yàn)過程遵循吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則，將大鼠使用數(shù)量及承受痛苦降到最低。為大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)的食物和自來水。

1.2　初級抗體

MAOB起初是從牛的肝臟線粒體中提純而來，用于制備兔抗MAOB抗血清[10]。在大鼠的腦中，這種抗血清可以通過免疫組化法將含有MAOB的細(xì)胞染色，而含有MAOA的細(xì)胞不著色。即這種抗血清特定的識別大鼠體內(nèi)的MAOB。

1.3　免疫組化方法-低倍鏡

根據(jù)之前的研究[11]，低倍鏡下觀察的MAOB的分布其免疫組化染色通常使用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。

取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，待大鼠麻醉后，打開胸腔，左心室插管至升主動(dòng)脈，先用pH7.4 0.01M磷酸緩沖液50 ml室溫下沖洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3% 戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸緩沖液300 ml灌注固定。灌畢后，立即取出大鼠舌體，將舌體再置入上述固定液中固定24 h。將舌體于低溫培養(yǎng)箱中30 μm冠狀切成切片，按以下程序培養(yǎng)：①含有0.3%聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸緩沖液(PBS)中室溫培養(yǎng)1 h；②含兔抗MAOB抗血清的PBS(1∶200 00)中4℃培養(yǎng)60 h；③于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶1 000)中室溫培養(yǎng)2 h；④于親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物中室溫培養(yǎng)2 h；⑤含有0.025% 3,3-二氨基聯(lián)苯胺、0.6%硫酸鎳按和0.006%過氧化氫的0.05 M的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS-HCl)緩沖液中室溫培養(yǎng)2 min。待培養(yǎng)完成后，將標(biāo)本用含有1%四氧化鋨的0.1M的磷酸緩沖液4℃固定1 h，環(huán)氧樹脂脫水包埋。置于光鏡下觀察其染色。

1.4　免疫組化方法-高倍鏡

同樣取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，待大鼠麻醉后，打開胸腔，左心室插管至升主動(dòng)脈，先用pH 7.4 0.01M磷酸緩沖液50 ml室溫下沖洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸緩沖液300 ml灌注固定。灌畢后，立即取出大鼠舌體，將舌體再置入上述固定液中固定24 h。固定后，將舌體用顯微用切片機(jī)50 μm冠狀切成切片，并保存于0.1M的磷酸緩沖液中。

我們采用免疫酶法用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物對MAOB進(jìn)行染色。染色方法如下：①含有0.001%胰蛋白酶(Ⅲ型)的磷酸緩沖液室溫下5 min；②含有5%羊血清的磷酸鹽緩沖液室溫下1 h；③兔抗MAOB抗血清(1∶60 000)混合1%的正常羊血清4℃下48 h；④于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶1 000)中室溫培養(yǎng)2 h；⑤于親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(1∶1 000)中室溫培養(yǎng)2 h；⑥含有0.025% 3,3-二氨基聯(lián)苯胺、0.6%硫酸鎳按和0.006%過氧化氫的0.05 M的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS-HCl)緩沖液中室溫培養(yǎng)10 min。待培養(yǎng)完成后，將標(biāo)本用含有1%四氧化鋨的0.1 M的磷酸緩沖液4℃固定1 h，環(huán)氧樹脂脫水包埋，用超微切片機(jī)切片。切片用乙酸雙氧鈾和鉛染色溶液染色，置于透射電鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1　免疫組化-低倍鏡

低倍鏡下，在大鼠舌頭的固有層中及上皮層中發(fā)現(xiàn)MAOB免疫陽性區(qū)，反應(yīng)陽性區(qū)域成暗黑色(圖1)。

圖1光鏡下大鼠舌上的MAOB的分布 MAOB免疫陽性區(qū)域位于上皮(EP，上箭頭)及固有層(LP，下箭頭)中。比例尺 50 μm

2.2　免疫組化-高倍鏡

電鏡下，我們發(fā)現(xiàn)有髓鞘軸突(圖2A)和無髓鞘軸突(圖3A)中存在MAOB免疫陽性區(qū)域。同時(shí)有髓鞘軸突的周邊的施萬細(xì)胞中也存在MAOB陽性區(qū)域(圖2B)。在MAOB陽性結(jié)構(gòu)中，我們發(fā)現(xiàn)MAOB免疫陽性物質(zhì)存在于軸突的線粒體外膜及其周圍。此外，并非所有的軸突線粒體外膜都呈陽性反應(yīng)，部分有髓鞘軸突(圖2B)、無髓鞘軸突(圖3B)和施萬細(xì)胞(圖3C)中的線粒體外膜成免疫陰性。

3討論

根據(jù)目前的研究，我們通過使用免疫組織化學(xué)的方法研究了一定數(shù)量的有髓鞘軸突和無髓鞘軸突。在電鏡下，有髓鞘纖維軸突及無髓鞘神經(jīng)纖維軸突中發(fā)現(xiàn)了大量的單胺氧化酶B陽性區(qū)域。陽性區(qū)域位于軸突內(nèi)線粒體外膜及其周圍。這就提出一個(gè)問題，是否MAOB不僅存在于線粒體外膜上而且還存在于線粒體外膜的周圍。MAOB免疫組化陽性區(qū)域?yàn)槎被?lián)苯胺的氧化產(chǎn)物，通過親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法用過氧化物酶催化形成[12]。在免疫組化使用過氧化物酶于電鏡觀察時(shí)，二氨基聯(lián)苯胺的氧化產(chǎn)物可以從原來抗原的位點(diǎn)上展開。此外，之前研究已經(jīng)在大鼠腸嗜鉻細(xì)胞證實(shí)MAOB顯著存在于線粒體外膜上。因此，MAOB主要是位于線粒體外膜上。

圖2A,B電鏡下MAOB大鼠舌神經(jīng)纖維的分布 MAOB免疫陽性區(qū)域位于有髓鞘軸突(A，大箭頭)和施萬細(xì)胞(B，大箭頭)的線粒體外膜及周圍。此外，部分有髓鞘軸突(A，B，小箭頭)中的線粒體外膜呈陰性反應(yīng)。比例尺 500 nm

圖3A,B,C 電鏡下， MAOB免疫陽性區(qū)域位于無髓鞘軸突(A，B，大箭頭)和的線粒體外膜及周圍。此外，無髓鞘軸突(B，小箭頭)和施萬細(xì)胞(C，小箭頭)中的部分線粒體外膜呈陰性反應(yīng)。比例尺500 nm

同時(shí)在有髓鞘和無髓鞘軸突中我們還發(fā)現(xiàn)并不是所有的線粒體呈現(xiàn)陽性特征。有的線粒體表面呈陽性表現(xiàn)，有一部分線粒體卻成陰性表現(xiàn)。即一部分線粒體外膜上含有MAOB，另一部分線粒體外膜上沒有這種酶。這種發(fā)現(xiàn)可能歸因于一種或者更多的原因：①人為造成，切片將該區(qū)域破壞；②不均勻的固定破壞了線粒體外膜上酶的活性；③部分線粒體自身就缺少這種酶[13]。MAOB的基因在人和鼠中都位于X染色體上，在大鼠中MAOB編碼在核基因，在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上合成。因此，MAOB在細(xì)胞質(zhì)中合成某種方式轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體外膜上，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出問題都可能導(dǎo)致MAOB的表達(dá)障礙。弄清楚這種表現(xiàn)不同的確切原因還需進(jìn)一步深入研究。

單胺氧化酶B是典型的線粒體外膜上內(nèi)嵌型酶，它在含多核糖體的細(xì)胞之內(nèi)合成，負(fù)責(zé)兒茶酚胺類、血清素、生物胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)氧化脫氨基作用[14]。MAOB主要作用于B-苯乙胺，對選擇性的抑制劑如丙炔苯丙胺敏感。在之前的研究中，已通過組織化學(xué)的方法證實(shí)了MAO存在于大鼠外周神經(jīng)，即坐骨神經(jīng)中，并證實(shí)了軸突外的MAO為生物胺的屏障系統(tǒng)。MAOB可代謝胺類神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)功能就是傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)，神經(jīng)遞質(zhì)正常的的合成與降解對軸突之間神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)有著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)MAOB在大鼠外周神經(jīng)軸突大量表達(dá)，為進(jìn)一步探討MAOB與軸突運(yùn)輸及神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)系提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

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關(guān)鍵詞：單胺氧化酶B；有髓鞘軸突；無髓鞘軸突；外周神經(jīng)系統(tǒng)；免疫組織化學(xué)

Immunocytochemical localization of monoamine oxidase type B in rat’s peripheral nervous systemCHENQiang，XUYang.(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatologyofJilinUniversity，ChangchunCity，130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of monoamine oxidase type B (MAOB) in rat’s peripheral nervous system to provide morphologic basis for further study about MAOB and the relationship between axon transportation and nerve impulse transduction.MethodsThe present study used immunohistochemical method to observe the localization of MAOB in rat’s peripheral nervous system.ResultsLight microscopy reveals that MAOB immunoreactivity is presented in epithelium above the lamina propria and lamina propria of rat’s tongue.Electron microscopy reveals that MAOB immunoreactivity is found in the myelinated axons and unmyelinated axons.MAOB immunoreactivity is also observed in the Schwann cell.In these MAO-B-positive structures,MAOB immunohistochemical reaction products are found on and around the mitochondrial outer membrane.ConclusionThe abundeant MAOB in rat’s peripheral nervous system indicates that MAO-B plays a critical role in axon transportation and nerve impulse transduction.

Key words:monoamine oxidase B；myelinated axon；unmyelinated axon；peripheral nervous system；immunohistochemistry

(收稿日期：2014-08-09)

作者簡介：陳強(qiáng)(1989-)，男，在讀研究生，碩士，研究方向：MAOB的定位分析。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R392.11

文章編號：1007-4287(2015)05-0713-04

*通訊作者