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氧化苦參堿注射液對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后作用的研究

王景祥1，姜微2，呂銘洋3， 張麗君4*

(1.吉林省柳河醫(yī)院,吉林 柳河135300;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 超聲科，吉林 長(zhǎng)春130033;

3.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2013屆研究生，吉林 延吉133000；4.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，吉林 延吉133000)

氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(So-phora flavescensAi.t)等中提取的生物堿,分子式為C15H24N2O,具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),OMT延緩烏頭堿所致大鼠心律失常的發(fā)生[1]，對(duì)TLR4表達(dá)有抑制作用[2]。降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),抑制Fas蛋白表達(dá),增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)[3]。而對(duì)于腦出血方面的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬腦出血模型,探討氧化苦參堿注射液對(duì)腦出血后作用的研究。

1材料與方法

1.1　藥品及試劑

OMT分子量264.36,純度>98%,由天津一方科技有限公司提供。批號(hào)：AW7660；丹參注射液由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)030623。乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)試劑盒。由中生北控生物科技股份有限公司提供，批號(hào)：130461,120811.超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及NO試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。批號(hào)：20130821,20130819，20130911。

1.2　儀器

磷酸鋅水門汀,上海青浦尼康齒科器械廠生產(chǎn);SN-2型腦立體定位儀,日本長(zhǎng)城產(chǎn);CJ型臺(tái)式牙鉆車上海產(chǎn);JD-2000型電子天平,沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;SSW-420-2S型電熱三用水箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;101A-1 型干燥箱,上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.3　動(dòng)物

Wis tar 雄性大鼠50 只,體重240-250 g(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供),按體重隨機(jī)分為5組,每組10只,即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥組( 丹參注射液1.5 ml/kg)、 氧化苦參堿注射液60 mg/kg、120 mg/kg劑量組。

1.4　方法

1.4.1建立大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血模型用10%水合氯醛(350 mg/kg 體重)腹腔麻醉大鼠,大鼠俯臥位固定在腦立體定位儀上,固定門齒于門齒鉤上,將左右水平針?lè)謩e穿破耳鼓膜并固定。將備皮后的大鼠頭部皮膚常規(guī)消毒,沿正中線切開(kāi),暴露顱骨、前囟和冠狀縫。找到前囟后,用鉆頭在顱骨表面鉆一直徑為1.0 mm圓孔,穿透顱骨但不傷及腦組織。將微量注射器取未肝素化的大鼠自體尾動(dòng)脈血50 μl,垂直插入腦組織,位置為右側(cè)尾狀核。采用一次緩慢方法將50 μl動(dòng)脈血緩慢注入尾狀核,注血速度約10 μl/min,注血時(shí)間約 5 min。用磷酸鋅水門汀封住鉆孔。局部涂抹青霉素粉,縫合皮膚,縫合尾部切口。局部碘酒消毒。注射用青霉素鈉6萬(wàn)單位肌肉注射,連續(xù)用4天,預(yù)防感染。假手術(shù)組操作過(guò)程同上,但不向腦內(nèi)注血。于術(shù)后12 h待大鼠清醒后進(jìn)行Longa氏評(píng)分,每天腹腔注射(ip) 給藥 1次,給藥容積均為0.2 ml/100 g,假手術(shù)組給予相同體積的生理鹽水,連續(xù)給藥5 日。所有大鼠在術(shù)后第5天于Longa氏評(píng)分后在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下腹主動(dòng)脈采血用于測(cè)定SOD、MDA及NO含量。取血離心測(cè)LDH及CK含量。

1.4.2神經(jīng)癥狀觀察按Zea Longa的方法對(duì)大鼠的行為障礙進(jìn)行分級(jí)評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)是:0分為未見(jiàn)神經(jīng)障礙癥狀;1分為將大鼠尾巴提起,癱瘓側(cè)前肢曲收于腹下,不能完全伸展左側(cè)前爪;2分為除1級(jí)體征外,大鼠置于光滑平面上,推手術(shù)側(cè)肩部向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)阻力降低;3分為除2級(jí)體征外,大鼠自由行走時(shí)向左側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)圈或傾倒;4分為大鼠出現(xiàn)軟癱,肢體無(wú)自由活動(dòng)。

1.4.3腦含水量測(cè)定用10%水合氯醛深度麻醉大鼠，迅速取出全腦，用濾紙吸干腦表面液體和血跡，以注射點(diǎn)為中心，前后各1 mm冠狀面切取腦組織片厚2 mm，精確稱量濕重后放入電熱恒溫箱內(nèi)80℃烘烤48 h,至恒重后稱取干重。按下列公式計(jì)算腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.4血漿SOD活性、MDA及NO含量的測(cè)定以10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血4 ml,0.2%肝素以1∶9 比例抗凝后1 000 r/min離心10 min,取血漿,按試劑盒要求操作,檢測(cè)SOD活性、MDA及NO含量。

1.4.5血清LDH及CK含量的測(cè)定取血離心，取大鼠血清用半自動(dòng)生化分析儀按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定乳酸脫氫酶和肌酸激酶含量。

2結(jié)果

2.1　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分影響

造模后5天，按ZeaLonga的方法對(duì)大鼠的行為障礙進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。與模型組比較,氧化苦參堿注射液各劑量組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠神經(jīng)行為學(xué)的

與假手術(shù)組比較###P< 0.001;與模型組比較**P< 0.01

2.2　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠腦含水量(BWC) 的影響

大鼠腦出血后，模型組大鼠腦含水量明顯增加(P<0.05) ;氧化苦參堿注射液各劑量組腦含水量與模型組比較均明顯下降(P<0.05,P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠腦含水量的

與假手術(shù)組比較##P< 0.01;與模型組比較*P< 0.05，**P< 0.01

2.3　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠血漿中 SOD、 MDA及NO含量的影響

各組大鼠血漿中 SOD、 MDA及NO含量見(jiàn)表3。與模型組比較,氧化苦參堿注射液30、60 mg.kg-1組，丹參注射液1.5 ml·kg-1組，SOD、MDA及NO含量明顯改變(P<0.05，P<0.01)。

±s，n=10)

與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05，**P< 0.01

2.4　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠血清中LDH、CK含量的影響

模型組大鼠術(shù)后血清中乳酸脫氫酶、肌酸激酶含量明顯增高,陽(yáng)性組與氧化苦參堿注射液組均可顯著降低大鼠血清中乳酸脫氫酶、肌酸激酶含量(表4)。

表4　氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠血漿LDH

與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05，**P< 0.01

3討論

腦出血后顱內(nèi)壓急劇增高,與迅速形成的顱內(nèi)血腫共同作用,導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧,甚至水腫、壞死,進(jìn)而引起受損區(qū)域神經(jīng)功能缺損,出現(xiàn)受損神經(jīng)組織所支配側(cè)軀體肌張力減弱、癱瘓甚至死亡等行為障礙癥狀[4]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦出血后，于120 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，根據(jù)觀察，在注射自體動(dòng)脈血液后，大鼠迅速出現(xiàn)行為和功能異常，出現(xiàn)病變對(duì)側(cè)肢體不同程度的癱瘓，其功能異常程度與病變嚴(yán)重程度一致。 腦出血后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞變性、水腫、壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失。因此,神經(jīng)行為障礙癥狀常用作反映神經(jīng)功能狀況的重要指標(biāo)。

自由基具有很強(qiáng)的氧化性，具有強(qiáng)烈的引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，當(dāng)腦出血機(jī)體組織缺血缺氧時(shí)，氧合作用降低，致SOD活性下降，損傷細(xì)胞膜，使細(xì)胞死亡。氧自由基被破壞，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成一系列的脂質(zhì)過(guò)氧化物和降解產(chǎn)物丙二醛(MDA),MDA能與蛋白質(zhì)及脂質(zhì)交聯(lián)形成變性高分子聚合物而使其失去生理功能，當(dāng)其堆積到一定程度和一定量，可破壞核內(nèi)的DNA,RNA，使細(xì)胞萎縮死亡。因此SOD的含量直接地反映了腦出血后組織細(xì)胞抗自由基損傷的能力，而MDA的含量則間接地反映出腦出血后機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。NO合成過(guò)度時(shí)可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，促進(jìn)白由基的產(chǎn)生、抑制酶活性及線粒體呼吸，造成細(xì)胞能量衰竭而死亡[4]。

腦出血血清中LDH、CK水平明顯升高,血清中LDH、CK水平的高低能一定程度上反映腦組織損傷的程度。而血清中LDH、CK水平常作為判斷腦細(xì)胞膜損傷程度的間接指標(biāo)[5]。

本實(shí)驗(yàn)表明氧化苦參堿注射液能夠減輕腦出血后血腫周圍組織損傷，從而降低腦水腫，改善腦出血后的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)。通過(guò)氧化苦參堿注射液治療可顯著提高腦出血后大鼠血漿SOD活性,降低MDA、NO水平,降低大鼠血清LDH、CK水平，表明氧化苦參堿注射液對(duì)急性腦出血大鼠的上述治療作用與提高腦組織內(nèi)內(nèi)源性抗氧化酶活性、抑制組織過(guò)氧化等機(jī)制密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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(收稿日期：2014-08-07)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)05-0710-03

*通訊作者