黃彤輝

南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南省衡陽市　421002

β-catenin蛋白在紫杉醇治療宮頸癌中表達(dá)的研究

黃彤輝

南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南省衡陽市421002

摘要目的：本研究通過檢測β-catenin蛋白在紫杉醇治療宮頸癌過程中的表達(dá), 探討wnt/β-catenin信號通路在紫杉醇治療宮頸癌中的作用機(jī)制。方法：MTT 比色法檢測不同濃度紫杉醇對人宮頸癌Caski細(xì)胞株增殖的影響，計(jì)算抑制率及IC50，對照組未予紫杉醇處理，而實(shí)驗(yàn)組則加入紫杉醇(IC50終濃度)，采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測兩組Caski細(xì)胞β-catenin 蛋白表達(dá)。結(jié)果：采用不同紫杉醇溶液濃度分別作用Caski細(xì)胞24h、48h及72h后，通過MTT比色法檢測結(jié)果顯示對細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，IC50值由IC50專用計(jì)算軟件求得IC50=(6.04±1.70)nmol/L。實(shí)驗(yàn)組和對照組β-catenin蛋白于胞漿胞核中均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組β-catenin蛋白表達(dá)陽性率為39.3%，對照組β-catenin蛋白表達(dá)陽性率為71.7%，實(shí)驗(yàn)組中陽性率明顯減少(P<0.05)。紫杉醇對Caski細(xì)胞增殖的影響呈劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組β-catenin蛋白表達(dá)陽性率為39.3%，對照組β-catenin蛋白表達(dá)陽性率為71.7%，實(shí)驗(yàn)組中陽性率明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：單純應(yīng)用一定濃度的紫杉醇均能抑制Caski細(xì)胞的增殖。紫杉醇能夠抑制宮頸癌Caski細(xì)胞內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)，呈濃度依賴性，從而阻斷wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路，同時影響癌基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)宮頸癌Caski細(xì)胞的凋亡。

關(guān)鍵詞紫杉醇β-catenin蛋白wnt/β-catenin信號通路

The Study on Expression of β-catenin Protein after Paclitaxel on Cervical Cancer

HUANG Tonghui.AffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,HengyangCity，Hu’nanProvince421002

ABSTRACT Objective:In this study, the core protein expression changes of wnt/β-catenin signaling pathway detected from protein levels after paclitaxel on Caski cells, and then exploring the mechanism of the wnt/β-catenin signaling pathway in the course of paclitaxel treatment of cervical cancer.Methods:To detect with different density of paclitaxel on the proliferation of human cervical carcinoma Caski cell by MTT colorimetric assay. Calculated inhibition ratio and IC50.Experimental group added paclitaxel. Control group were not treated incubator.β-catenin protein expression were detected by immunohistochemistry.Results:The inhibitory effect on the cell increase while the drug concentration increased. In experimental group, the positive rate was 39.3%. In control group, the positive rate was 71.7%. The positive rate in experimental group was significantly decreased (P<0.05).Conclusion:The effect of Paclitaxel inhibiting Caski cell is exact. Application of a certain concentration of paclitaxel merely can inhibit the proliferation of Caski cells. Paclitaxel can inhibit the expression of β-catenin protein in cervical cancer Caski cells,thereby blocking the wnt/ β -catenin signal transduction pathway, and inducing apoptosis of cervical cancer Caski cell.

KEY WORDS Paclitaxel,β-catenin, wnt/β-catenin signaling pathway

1材料與方法

1.1宮頸癌細(xì)胞株的建立人宮頸癌Caski細(xì)胞株由南華大學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室傳代保存。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌Caski細(xì)胞，取80%~90%對數(shù)生長期且生長至鋪滿培養(yǎng)瓶的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2MTT比色法檢測不同濃度紫杉醇對人宮頸癌Caski細(xì)胞株增殖的影響細(xì)胞貼壁約2h后加入不同濃度紫杉醇溶液各100μl，各實(shí)驗(yàn)組紫杉醇溶液的濃度分別為0.001μg/ml、0.010μg/ml、0.100μg/ml、1.000μg/ml、10.000μg/ml、100.000μg/ml、1 000.000μg/ml。每種濃度設(shè)5個復(fù)孔。對照組為新鮮培養(yǎng)液(含 10%的胎牛血清)。每孔加入0.5%噻唑藍(lán)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)約4h。加入含胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基終止培養(yǎng)， 每孔加入250μl二甲基亞砜溶液，測量各孔的吸光值(OD)：計(jì)數(shù)抑制率及IC50值；以空白調(diào)零計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1- (實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%；IC50值由IC50專用計(jì)算軟件求得。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組至少設(shè)置5個副孔。

1.3細(xì)胞免疫組化法觀察β-catenin蛋白在人宮頸癌Caski細(xì)胞中的表達(dá)滴加正常山羊血清工作液1~2 滴(將細(xì)胞覆蓋完)，37℃孵育 30min， 滴加一抗(兔抗人β-catenin 單克隆抗體25μg/ml)置 4℃冰箱孵化過夜，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，置4℃冰箱過夜。 生物素標(biāo)記二抗，滴加過氧化物酶(辣根過氧化物酶)約 2 滴，37℃溫箱中孵育 15min，DAB 顯色， 蘇木素復(fù)染1min，封片，置鏡下觀察。

1.4顯微鏡下圖像判斷標(biāo)準(zhǔn)觀察染色結(jié)果：以在胞漿、細(xì)胞核和(或)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕褐色細(xì)小顆粒為本實(shí)驗(yàn)中β-catenin蛋白的陽性表達(dá)。高倍鏡(×400)下根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)進(jìn)行半定量分析。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：A染色強(qiáng)度：3分為黃褐色，2分為棕黃色，1分為淡黃色，0分為不著色；B計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：以序列方式隨機(jī)選取20個高倍視野(×400)，每個視野中(從左至右，從上至下)計(jì)數(shù)100個完整的腫瘤細(xì)胞。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照著色細(xì)胞的百分率記分，分為0~4分(其中0分為<5%， 1分為5%~25%， 2分為26%~50%， 3分為50%~75%， 4分為>75%)。

2結(jié)果

2.1不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細(xì)胞株增殖的影響本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度紫杉醇溶液分別作用Caski細(xì)胞24h、48h及72h后，通過MTT比色法檢測結(jié)果顯示，對細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，隨藥物作用的時間延長而增強(qiáng)。單純應(yīng)用某一濃度的紫杉醇均能抑制Caski細(xì)胞的增殖，其對增殖的影響呈劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。IC50=(6.04±1.70)nmol/L。見圖1和表1。

不同濃度紫杉醇(μg/ml)

圖1不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細(xì)胞增殖的影響

2.2紫杉醇對β-catenin蛋白在Caski細(xì)胞中表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)組和對照組β-catenin蛋白于胞漿、細(xì)胞核和(或)胞膜內(nèi)中均有表達(dá)(見圖2、3)，對照組

wnt/β-catenin途徑的異常激活是宮頸癌重要的發(fā)病機(jī)制[1]，可以通過檢測β-catenin的表達(dá)水平來判斷wnt/β-catenin信號通路的激活水平。wnt/β-catenin信號通路在紫杉醇治療宮頸癌中的作用機(jī)制目前尚不明確，因此, 探討紫杉醇治療宮頸癌過程中對wnt/β-catenin信號通路的影響對臨床將有重要的指導(dǎo)意義。本研究以不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細(xì)胞株增殖的影響為立足點(diǎn)，用免疫組化法檢測wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin蛋白表達(dá)，以研究紫杉醇對宮頸癌腫瘤細(xì)胞wnt/β-catenin信號通路的影響，進(jìn)而探索該信號通路在紫杉醇抗腫瘤作用中的具體機(jī)制。

表1　紫杉醇對宮頸癌Caski細(xì)胞抑制

注：同一組與24h時間組段相比較P<0.05；同一時間與0.001μg/ml濃度相比較P<0.05。

棕黃色顆粒者更致密，呈團(tuán)塊狀。實(shí)驗(yàn)組陽性率為39.3%，對照組陽性率為71.7%。實(shí)驗(yàn)組中β-catenin蛋白表達(dá)陽性率明顯減少(P<0.05)。

圖2對照組Caski細(xì)胞中圖3紫杉醇作用后Caski細(xì)胞中

β-catenin蛋白(s-p法×400)β-catenin蛋白(s-p法 ×400)

3討論

紫杉醇類屬于細(xì)胞周期特異性藥物，其藥理機(jī)制主要是通過結(jié)合到微管蛋白上，阻滯其解聚成亞單位，并促進(jìn)微管蛋白的聚合，在婦科惡性腫瘤治療中起著越來越重要的作用[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在惡性腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)腫瘤的形成發(fā)展過程中，越來越多的基因及信號通路參與其中，其中wnt/β-catenin通路便是研究的熱點(diǎn)之一。wnt/β-catenin信號通路在促進(jìn)及維持腫瘤干細(xì)胞的增殖、成瘤性、耐藥性等諸多方面起著重要作用，該作用在白血病、淋巴癌、皮膚癌等腫瘤中已被證實(shí)[3]。β-catenin蛋白是一種多功能蛋白，是wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的核心元件，其充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子作用，在細(xì)胞核內(nèi)啟動并激活促使細(xì)胞分裂的基因，其介導(dǎo)的wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路異常激活在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[4]。

目前關(guān)于紫杉醇對wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的作用機(jī)理尚不明確，因此檢測β-catenin蛋白的異常表達(dá)情況可幫助判斷wnt/β-catenin信號通路在紫杉醇治療宮頸癌過程中的可能作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度紫杉醇溶液分別作用Caski細(xì)胞24h、48h及72h，通過MTT比色法檢測宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度紫杉醇均能造成Caski細(xì)胞的凋亡，其對增殖的影響呈劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。紫杉醇實(shí)驗(yàn)組β-catenin蛋白表達(dá)水平在Caski細(xì)胞中表達(dá)明顯下降。本實(shí)驗(yàn)揭示了紫杉醇作用Caski細(xì)胞的可能機(jī)制：紫杉醇導(dǎo)致Caski細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平下降，

使wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵的信號介質(zhì)減少，進(jìn)而使信號傳遞過程中斷受阻，進(jìn)而影響Caski細(xì)胞的繼續(xù)增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管本實(shí)驗(yàn)對紫杉醇藥物影響wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路具體分子學(xué)機(jī)制未做相關(guān)闡述，但為進(jìn)一步探討紫杉醇藥物調(diào)控腫瘤信號傳導(dǎo)通路提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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(編輯落落)

收稿日期2014-10-13

中圖分類號：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)03-0305-03