朱海鷗，王立新，侯文彬，單 淇，周福軍

(1. 天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192； 2. 天津藥物研究院，天津 300193)

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中藥土貝母活性成分總皂苷的含量測定

朱海鷗1，王立新1，侯文彬2*，單 淇2，周福軍2

(1. 天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192； 2. 天津藥物研究院，天津 300193)

目的：建立土貝母總皂苷的含量測定方法。方法：對比色法測定土貝母總皂苷的各因素進(jìn)行單因素考查以及正交試驗(yàn)，優(yōu)化比色條件，確定最佳測定方法。結(jié)果：土貝母總皂苷的最佳測定條件為顯色劑(5%香草醛-冰醋酸溶液)0.2 ml，高氯酸0.4 ml，70 ℃下反應(yīng)30 min，立即冰水浴冷卻5 min，取出后加入4 ml冰醋酸溶液，再冰水浴冷卻10 min，取出室溫放置35 min后進(jìn)行紫外測定。土貝母總皂苷在0.049～0.293 mg范圍內(nèi)線性良好。結(jié)論：本法對土貝母總皂苷進(jìn)行含量測定準(zhǔn)確穩(wěn)定，可作為評價(jià)土貝母藥材以及土貝母皂苷原料藥和制劑的重要質(zhì)量控制方法之一。

土貝母，總皂苷，比色法，含量測定

疣病是一種病毒性皮膚病，是由病毒引起的一種皮膚表面贅生物，多見于兒童及青少年，常見的有尋常疣、扁平疣、尖銳濕疣、傳染性軟疣等。前三者是由乳頭瘤病毒引起，后者是由傳染性軟疣病毒引起。疣病好發(fā)于面部、手背部等暴露部位，有一定傳染性，給身邊親人的身心健康帶來巨大的威脅。土貝母為葫蘆科植物土貝母[Bolbostemmapaniculatum(Maxim)Franquet]的干燥塊莖，味苦，性微寒，歸肺、脾經(jīng)，有散結(jié)、消腫、解毒之功。土貝母水煎液對各種疣類疾病均取得滿意的治療效果。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其皂苷成分具有很好的抗病毒作用[1]，抗病毒譜主要包括乳頭多瘤空泡病毒中人疣病毒、痘病毒中傳染性軟疣病毒和HSV-1[2]。因此，土貝母對各種疣病都有很好的療效，目前大多用于醫(yī)院內(nèi)部制劑[3]。本文擬制定土貝母總皂苷的質(zhì)量控制方法，作為評價(jià)土貝母藥材以及土貝母皂苷原料藥和制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

香草醛(天津市清華津英科技有限公司，分析純)，冰醋酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，分析純)，高氯酸(天津化學(xué)試劑二廠，分析純)。UV-1601紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)，恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。土貝母藥材(購自河北省安國市藥材市場，經(jīng)天津藥物研究院侯文彬研究員鑒定)，土貝母苷甲對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號1536-200001 )。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2．1.1 對照品溶液的配制 精密稱取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)品加甲醇定容制成每1 ml含約1 mg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2．1.2 供試品溶液的配制 取土貝母藥材粗粉2.5 kg，以 60%的乙醇20倍體積(8∶6∶6)，提取3次，每次1.5 h，濃縮藥液后以0.2 g/ml的藥材濃度上樣于處理好的NKA-9樹脂(體積約為4 L)，以7 BV水洗脫除雜后，再用3 BV的95%乙醇洗脫即得到土貝母總皂苷，上樣、洗脫流速為3 BV/h，制得土貝母總皂苷樣品。精密稱取土貝母總皂苷樣品加甲醇定容制成每1 ml含0.5 mg的供試品溶液。

2.2 最大吸收波長的確定 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液適量，至具塞試管中，揮干溶劑，各加入0.2 ml 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.1 ml高氯酸，搖勻于70 ℃水浴下反應(yīng)20 min，取出冰浴1 min中止反應(yīng)，精密加入冰醋酸4 ml，搖勻后冷卻10 min，于400～800 nm波長下進(jìn)行掃描，在472 nm波長下出現(xiàn)最大吸收，選取472 nm為測定波長。

2.3 顯色條件的選擇

2.3.1 香草醛濃度的考查 精密吸取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml，分別置10 ml具塞試管中，精密加入新配制的不同濃度香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml和高氯酸溶液0.1 ml，搖勻，密塞，置70 ℃水浴中加熱20 min，取出，立即放入冷水中冷卻1 min，精密加入冰醋酸4 ml，搖勻，繼續(xù)冷卻10 min，以試劑作空白，在472 nm下測定吸收度，結(jié)果當(dāng)香草醛濃度大于5%后，吸光值變化不大，所以本實(shí)驗(yàn)選擇5%濃度的香草醛-冰醋酸溶液作為顯色劑。

2.3.2 顯色反應(yīng)穩(wěn)定性的考查 取0.5 ml土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法顯色反應(yīng)后，進(jìn)行紫外檢測，每隔5 min記錄一下吸光值。結(jié)果在顯色反應(yīng)結(jié)束后，室溫下放置35 min后，吸光值變化幅度較小，趨于穩(wěn)定。

2.3.3 最佳反應(yīng)溫度的選擇 吸取0.5 ml甲醇溶液于具塞試管中揮干后，按上述方法分別在60、70、80和90 ℃不同溫度下進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察空白溶液的吸收值。結(jié)果當(dāng)溫度超過70 ℃以后，空白溶液的吸光值增加明顯，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)干擾增大，本實(shí)驗(yàn)選擇70 ℃作為顯色反應(yīng)的反應(yīng)溫度。

2.3.4 比色條件的優(yōu)化 考慮顯色劑與高氯酸用量之間可能存在交互作用，本實(shí)驗(yàn)選擇以香草醛-冰醋酸溶液體積、高氯酸體積、交互作用項(xiàng)、加熱時間、中止反應(yīng)時間為考查因素，每個因素下選擇3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，做一L18(37)正交表(見表1)，分別精密吸取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 ml，結(jié)果如表2和表3。

表1 比色條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)表

表2 比色條件優(yōu)化數(shù)據(jù)表

表3 方差分析數(shù)據(jù)表

*表示P<0.05

對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，只有顯色劑體積、高氯酸體積和加熱時間具有顯著性差異。由直觀分析可知，三者的主次順序?yàn)锽(高氯酸體積)>A(顯色劑體積)>C(加熱時間)，再由分析結(jié)果的均值大小可確定優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為：B3A1C3D2， 即顯色劑(5%香草醛-冰醋酸溶液)0.2 ml，高氯酸0.4 ml，70 ℃下反應(yīng)30 min，立即冰水浴冷卻5 min，取出后加入4 ml冰醋酸溶液，再冰水浴冷卻10 min，取出室溫放置35 min，進(jìn)行紫外測定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 ml至6支具塞試管中揮干溶劑，按照正交試驗(yàn)優(yōu)選比色條件進(jìn)行顯色反應(yīng)，以土貝母苷甲量與吸光度進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=2.882 1X+ 0.116(r=0.999 5)。表明土貝母苷甲在0.049～0.293 mg范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 ml，按照測定方法顯色后連續(xù)測定6次，RSD為0.12%, 儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取對照品并定容配成6份標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，各吸取0.2 ml至6個具塞試管中，同“2.4”項(xiàng)下方法顯色，于472 nm處測定A值，測得A值平均為0.684，RSD為1.9%(n=6)。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密吸取供試品溶液0.2 ml于9支具塞試管中，分別精密加入對照品溶液約相當(dāng)于樣品總皂苷量的80%、100%和120%，各3份，按照測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算平均回收率為98.16%，RSD為1.9%，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 香草醛-高氯酸常用作三萜皂苷的顯色劑。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化香草醛-高氯酸比色條件時考慮到顯色劑與高氯酸的用量之間可能存在的交互作用，做一L18(37)正交設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)交互作用項(xiàng)無顯著性差異，即顯色劑與高氯酸在用量比例上沒有內(nèi)在聯(lián)系，這也證實(shí)了顯色反應(yīng)是分步進(jìn)行的，其顯色原理可能是皂苷在強(qiáng)氧化性酸的作用下脫氫，氧化后再與香草醛加成[4]。顯色后，香草醛-高氯酸能與皂苷反應(yīng)形成特征的紫紅色。因?yàn)槟承┨且簿咭妆谎趸摎涞男再|(zhì)，可能對此種含量測定方法存在一定干擾，以致常常出現(xiàn)實(shí)測值偏大的現(xiàn)象，所以要求在制備總皂苷樣品的工藝中進(jìn)行水洗脫除糖的操作，以盡量避免糖類物質(zhì)對顯色反應(yīng)的干擾。

3.2 顯色反應(yīng)對于加熱時間和溫度的變化比較靈敏，操作中應(yīng)嚴(yán)格控制加熱時間和溫度，且待顯色樣品需揮干溶劑后加入顯色劑，否則對顯色效果影響較大。5%香草醛-冰醋酸溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，放置時間過久會出現(xiàn)空白溶液吸光值加大的現(xiàn)象，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 傅章才,趙更生,房益藍(lán)，等.土貝母皂苷的藥理學(xué)研究[J].陜西新醫(yī)藥,1985，14(4)：49-53

2 張曉輝,孫乃學(xué),王峰，等.單純皰疹病毒性角膜炎土貝母皂甙點(diǎn)眼的濃度篩選與刺激性評價(jià)[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào),2003, 24(1)：63-66

3 紀(jì)家貴.解毒消疣湯治療傳染性軟疣36例[J].河南中醫(yī),2001, 21(4)：43-44

4 蘭霞,王洪新.比色法測定甘草中總皂苷的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(4)：886-887

Deter mination of total tubeimosides inBolbostemmapaniculatum

Zhu Haiou1,Wang Lixin1,Hou Wenbin2,Shan Qi2,Zhou Fujun2

(1.Tianjin Second People’s Hospital,Tianjn，300192；2.Tianjin Institute of Pharmaceutical research, Tianjin 300193)

Objective：To establish an analysis method for the quantitative deter mination of total tubeimosides . Methods：The factors affecting the deter mination of total tubeimosides were researched by the single factor exploration and orthogonal design.The most appropriate one was selected and the method was optimized subsequently.Results：Total tubeimosides was well determined with 5% vanilin- glacial acid solution(0.2 ml) and perchloric acid(0.4 ml) as developer and 30 minutes at 70 ℃.The sample was cooled with ice -water bath for 5 min,taken out and added with 4 ml of acetic acid and cooled for 10 min again.The sample was UV detected following being cooled for 35 min at ambient temperature. Total tubeimosides was in good linearity between 0.049 mg and 0.293 mg. Conclution: This quantitative deter mination method for total tubeimosides is accurate and stable.It can be used for a main quality control of Bolbostemma paniculatum and total tubeimosides.

Bolbostemmapaniculatum，total tubeimosides，colorimetry，deter mination

2015-01-19

R927.2

A

1006-5687(2015)04-0014-03

*通訊作者：侯文彬，E-mail：hou-zhang@126.com。