李 亮，白 雪，馮文茹，周 潔*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150； 2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

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實(shí)驗(yàn)研究

SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型建立方法的改進(jìn)

李 亮1，白 雪1，馮文茹2，周 潔1*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150； 2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

目的：通過(guò)對(duì)造模方法的調(diào)整，找尋建立簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定的SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型的方法。方法：對(duì)造模中接種細(xì)胞懸液數(shù)量、MRI檢測(cè)造影劑的選擇以及MRI檢測(cè)造影劑注射方式進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)行MRI以及病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：在對(duì)造模方法進(jìn)行調(diào)整后，MRI檢測(cè)可見(jiàn)腫瘤組織明顯強(qiáng)化，病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)造模成功。結(jié)論：通過(guò)對(duì)造模方法進(jìn)行調(diào)整，造模成功率得以提高，對(duì)造模方法有一定認(rèn)識(shí)。

腦膠質(zhì)瘤，動(dòng)物模型，造模方法改進(jìn)

腦膠質(zhì)瘤是臨床最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，易復(fù)發(fā)，病死率極高[1]。闡明腫瘤細(xì)胞侵襲的潛在機(jī)制有助于提高治療效果，需要利用動(dòng)物模型來(lái)研究腦膠質(zhì)瘤的侵襲性及其對(duì)大腦結(jié)構(gòu)和功能的影響[2]。因此，建立成熟、穩(wěn)定的腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，對(duì)進(jìn)一步了解和研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療方法是有必要的。采用立體定向技術(shù)建立SD大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的實(shí)驗(yàn)方法國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多，本實(shí)驗(yàn)組采用文獻(xiàn)報(bào)道較多的實(shí)驗(yàn)方法建立腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，結(jié)果成功率偏低；在對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行調(diào)整后，成功率有所提高，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院提供。SD大鼠，雄性，體重220～240 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2009-007，動(dòng)物合格證號(hào)0001506。

1.2 藥品 釓雙胺注射液[規(guī)格 15 ml∶4.305 g，購(gòu)自通用電氣藥業(yè)(上海)有限公司，批號(hào)11870116]。水合氯醛[規(guī)格100 ml∶10 g，購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，院內(nèi)制劑]?？蹬商蒯t(yī)用膠噴霧劑[規(guī)格噴霧型1.5 ml/支，批號(hào)120125]。

1.3 試劑 Hyclone血清(批號(hào)GDB0058；購(gòu)自天津瑞博星科技有限公司)。培養(yǎng)基(DMEM/F12，批號(hào)1285082，購(gòu)自GIBCO公司)。

1.4 儀器設(shè)備和器械 培養(yǎng)瓶(規(guī)格25 ml、75 ml。批號(hào)430168，購(gòu)自美國(guó)Corning公司)。CO2孵育箱(C-2021型，購(gòu)自TyTe公司)。臺(tái)式離心機(jī)(LD4-2型，購(gòu)自北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。PL-203型電子天平(購(gòu)自Mettler-Toledo公司)。生物光學(xué)顯微鏡(日本產(chǎn)，Nikon)。微量進(jìn)樣器(規(guī)格25 μl，購(gòu)自上海高鴿工貿(mào)有限公司)。西門子Verio 3.0T成像系統(tǒng)：層厚1.5 T，F(xiàn)ov 80 mm×80 mm(視野內(nèi))，層距0.15 mm，冠狀、矢狀及橫斷面T1加權(quán)(TR/TE=540/22 ms)，T2加權(quán)(TR/TE=4 400/22 ms)，T1加權(quán)掃描。

1.5 方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)方法與改進(jìn) (1)在接種細(xì)胞數(shù)量方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者制作C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型接種的細(xì)胞數(shù)量在105～107之間[3～6]。在實(shí)驗(yàn)初期，本實(shí)驗(yàn)組采取以下方法接種：①C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)；②將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、離心后，以含瓊脂糖(15 mg/ml)，不含血清的DMEM/F12混合培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為3×107/ml；③SD大鼠用10%的水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒、鋪巾、切開(kāi)，暴露前囟，用牙科鉆于中線右3.5 mm、冠狀縫后1 mm處鉆孔。以顱骨表面計(jì)算，進(jìn)針3.5 mm，退0.5 mm，在皮層和白質(zhì)交界處，接種C6細(xì)胞，以25 μl注射器吸取細(xì)胞懸液，接種量為10 μl，注射速度1 μl/min，注射完畢留針5 min；④骨蠟封閉骨孔；⑤表面皮膚傷口用醫(yī)用膠粘合。大約1 h后動(dòng)物蘇醒，隨時(shí)觀察動(dòng)物的狀態(tài)。觀察14 d后，照射核磁。但經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)。后采取勻漿法制備細(xì)胞懸液，再次接種，效果仍不理想。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)接種細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行提高，將接種細(xì)胞濃度調(diào)整為3×109/ml。

(2)在MRI檢測(cè)造影劑選擇方面，文獻(xiàn)報(bào)道采用注射釓噴酸葡胺作為顯影劑的方法[7，8]。本實(shí)驗(yàn)采用注射釓雙胺注射液0.4 ml/只進(jìn)行MRI掃描。

(3)在MRI檢測(cè)造影劑注射方式方面，文獻(xiàn)報(bào)道采用鼠尾靜脈注射造影劑[9]的方法。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射釓雙胺注射液。

1.5.2 病理學(xué)檢測(cè)方法 經(jīng)10%福爾馬林液固定腦組織標(biāo)本，取材腫瘤接種部位，酒精梯度脫水，Leica EG1150H自動(dòng)生物組織包埋機(jī)包埋，Leica RM2255切片機(jī)制片，HE染色，OLYMPUS顯微鏡觀察，IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖象分析系統(tǒng)采圖。

2 接種方法改進(jìn)結(jié)果

在接種方法改進(jìn)后，接種成功率達(dá)70%左右。在MRI檢測(cè)造影劑選擇和注射方式方面，采用注射釓雙胺注射液進(jìn)行MRI掃描，成功顯影腦膠質(zhì)瘤接種情況。注射方式方面，采用腹腔注射釓雙胺注射液成功率高，不影響MRI增強(qiáng)掃描的效果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況 大鼠接種后3 d開(kāi)始，大鼠運(yùn)動(dòng)量逐漸減少，攻擊性下降。繼而飲水進(jìn)食減少，皮毛不整潔并失去光澤，精神萎靡，對(duì)側(cè)或雙側(cè)放置反射損害，偏癱進(jìn)行性加重。后期，大鼠面部不整潔，眶周出血，對(duì)刺激反應(yīng)減弱甚至呈木僵狀，偶有癲癇發(fā)作。瀕死前表現(xiàn)為極度惡液質(zhì)，呼吸衰竭。

3.2 MRI檢測(cè) 經(jīng)MRI檢測(cè)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組SD大鼠造模成功，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 對(duì)照組SD大鼠正常腦組織

圖2 實(shí)驗(yàn)組SD大鼠腦組織中瘤體情況(箭頭所指)

3.3 病理學(xué)檢測(cè) 可見(jiàn)腫瘤組織血管豐富，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核分裂相易見(jiàn)，瘤細(xì)胞惡性特征明顯，未見(jiàn)明顯包膜，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，可見(jiàn)腫瘤組織變性，中心可見(jiàn)明顯的出血及小片狀、大片狀壞死或柵欄狀壞死，證實(shí)造模成功，見(jiàn)圖3。

圖3 腫瘤組織血管豐富

4 討論

建立可靠、穩(wěn)定的動(dòng)物模型是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型是腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最為廣泛的模型之一[10]。

4.1 C6細(xì)胞是經(jīng)N-亞硝基甲脲(N-nitrosomethy-lurea)誘發(fā)的鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與大鼠腦組織有很好的相容性，種植成功率高，腫瘤生長(zhǎng)快，其生長(zhǎng)特點(diǎn)與人腦膠質(zhì)瘤較為接近，是制作大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的理想細(xì)胞。

在實(shí)驗(yàn)初期，采取單細(xì)胞懸液直接接種的方法，未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)?？紤]改進(jìn)制作實(shí)體模型的方法：①采取將單細(xì)胞懸液直接接種于大鼠皮下的方法，腫瘤雖生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)率為60%左右，效果不佳；②使用腫瘤組織切塊直接接種，亦未見(jiàn)生長(zhǎng)。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，高斌等[11]研究發(fā)現(xiàn)勻漿法制備單細(xì)胞懸液省時(shí)省力，且單細(xì)胞產(chǎn)率高，檢測(cè)準(zhǔn)確性更好，更適合于實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備。因此，本實(shí)驗(yàn)組將腫瘤組織剪成小塊狀，放入勻漿機(jī)樣本槽內(nèi)，加適量PBS液，打開(kāi)勻漿機(jī)開(kāi)關(guān)，2 min后關(guān)閉，打開(kāi)樣本槽，20 ml注射器抽取組織勻漿，用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾到冰預(yù)冷的試管內(nèi)；1 500 r/min×5 min離心沉淀，去上清，試管內(nèi)加PBS液輕微振蕩混勻后，300目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾去細(xì)胞團(tuán)塊，500 r/min×5 min離心沉淀去上清，試管內(nèi)加15 ml PBS液輕微振蕩混勻后，300目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾去細(xì)胞塊，后用注射器接種。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)勻漿法制備的細(xì)胞懸液接種成功率為50%左右，效果仍不佳。考慮原因可能為選取的腫瘤組織成囊性，中間有液體，邊緣組織韌性較大，造成勻漿不完全，影響細(xì)胞懸液質(zhì)量。文獻(xiàn)中屠玨[12]報(bào)道勻漿液移植法在制備勻漿懸液的過(guò)程中出現(xiàn)死亡細(xì)胞較多，接種后產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答較強(qiáng)，動(dòng)物狀態(tài)差，容易繼發(fā)感染，不推薦使用。因此，最終選擇提高接種細(xì)胞數(shù)量的方法，使得實(shí)驗(yàn)得以順利進(jìn)行?？梢?jiàn)接種的細(xì)胞數(shù)量與造模是否成功密切相關(guān)。并且，亦有報(bào)道稱接種懸液的細(xì)胞量影響造模的成功率[13]。

4.2 在造影劑選擇方面，釓雙胺與釓噴酸葡胺都為小分子順磁性造影劑，具有水溶性，不易通過(guò)正常腦組織的血腦屏障。但當(dāng)血腦屏障遭受破壞導(dǎo)致通透性增加時(shí)，兩者都可進(jìn)入受損血腦屏障，進(jìn)入病變組織。在影像學(xué)上，兩者均能在MRI檢查中，作為人體頭顱核磁共振檢查的造影增強(qiáng)劑。

但在膠質(zhì)瘤小鼠模型中，MRI造影劑釓噴酸葡胺顯像失敗，釓雙胺顯像成功，分析原因可能如下：①膠質(zhì)瘤對(duì)血腦屏障通透性的影響。文獻(xiàn)報(bào)道[14]膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別與血腦屏障通透性有關(guān)。膠質(zhì)瘤小鼠模型由于膠質(zhì)瘤初形成，有可能對(duì)血腦屏障的影響不足以大到使造影劑通過(guò)血腦屏障的程度。②雙胺與釓噴酸葡胺兩藥的血腦屏障通過(guò)能力不同。兩藥均不能通過(guò)正常腦組織的血腦屏障。當(dāng)血腦屏障略有破壞時(shí)，藥物理化性質(zhì)就是決定藥物能否通過(guò)血腦屏障的關(guān)鍵因素。一般來(lái)說(shuō)，容易通過(guò)血腦屏障的藥物，應(yīng)該具有脂溶性強(qiáng)、親水性弱、分子量小的特點(diǎn)。釓雙胺為非離子型小分子造影劑，分子式為C16H26GdN5O8，分子量573.66；釓噴酸葡胺為離子型小分子造影劑，分子式為C14H20GdN3O10·2(C7H17NO5)，分子量938，分子結(jié)構(gòu)中多離子、多羥基結(jié)構(gòu)。顯然，釓噴酸葡胺分子量更大、親水性強(qiáng)、親脂性差，而釓雙胺由于其分子結(jié)構(gòu)多親脂性基團(tuán)、分子量小，相比較而言，當(dāng)血腦屏障有較小程度破壞時(shí)，釓雙胺比釓噴酸葡胺更易通過(guò)而到達(dá)病變組織。

4.3 在MRI檢測(cè)造影劑注射方式方面，鼠尾靜脈注射釓雙胺操作較困難，成功率不高。采用腹腔注射釓雙胺注射液，此法操作方便，可重復(fù)多次注射，不影響MRI增強(qiáng)掃描的效果。

本實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的造模方法進(jìn)行模型建立，結(jié)果不盡如人意。在改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法后，造模成功率得到提高，可見(jiàn)，動(dòng)物模型制作的結(jié)果受多種因素影響。因此，建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型，需要準(zhǔn)確定位，恰當(dāng)進(jìn)針深度，接種足量細(xì)胞，及選擇良好的造影劑，諸多因素協(xié)調(diào)配合，方能取得較為滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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2015-03-11

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃(No.11JCYBJC12500)

R965

A

1006-5687(2015)03-0001-03

*通訊作者：周潔，E-mail:cnzhoujie@126.com。