邢東亮，宋東奎，康鄭軍，酒 濤

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·論著·

Krüppel樣因子8及高遷移率族蛋白A2在膀胱尿路上皮癌組織的表達(dá)水平及其與預(yù)后的相關(guān)性

邢東亮，宋東奎，康鄭軍，酒 濤

目的 探討膀胱尿路上皮癌組織Krüppel樣因子8(KLF8)以及高遷移率族蛋白A2(HMGA2)表達(dá)水平及其與預(yù)后的相關(guān)性。方法 選取2012年1月—2013年10月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院就診的74例膀胱尿路上皮癌患者的腫瘤組織作為研究組，另選取同期在本院行膀胱切開取石術(shù)或開放前列腺切除術(shù)患者23例的膀胱黏膜作為對(duì)照組。采用免疫組化方法檢測(cè)兩組標(biāo)本組織中KLF8和HMGA2蛋白表達(dá)水平。采用Cox回歸分析KLF8及HMGA2蛋白的表達(dá)水平與患者生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 研究組KLF8和HMGA2表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.872，P=0.002；t=4.593，P=0.001)。膀胱尿路上皮癌患者臨床分期與KLF8和HMGA2表達(dá)水平均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.489、0.561，P<0.05)?；颊呔S訪至2015年4月，67例患者在隨訪截止時(shí)存活，總生存率為90.5%。多元Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床病理分期、KLF8和HMGA2表達(dá)水平是膀胱尿路上皮癌患者生存預(yù)后的影響因素(P<0.05)。結(jié)論 膀胱尿路上皮癌組織KLF8及HMGA2蛋白的高水平表達(dá)是患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

膀胱腫瘤；Krüppel樣因子；高遷移率族蛋白質(zhì)類；預(yù)后

邢東亮，宋東奎，康鄭軍，等.Krüppel樣因子8及高遷移率族蛋白A2在膀胱尿路上皮癌組織的表達(dá)水平及其與預(yù)后的相關(guān)性[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(26)：3185-3188.[www.chinagp.net]

Xing DL，Song DK，Kang ZJ，et al.Expression levels of KLF8 and HMGA2 protein in tissues of bladder urothelial carcinoma and their correlation with prognosis[J].Chinese General Practice，2015，18(26)：3185-3188.

臨床統(tǒng)計(jì)顯示，膀胱尿路上皮癌發(fā)病率在國內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)居泌尿系腫瘤的首位。治療關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，因此尋找靈敏度及特異度均較好的腫瘤標(biāo)志物來預(yù)測(cè)膀胱尿路上皮癌的生物學(xué)行為以及預(yù)后狀況是目前臨床的研究熱點(diǎn)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Krüppel樣因子8(Krüppel-like factor 8，KLF8)以及高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)可用于多種腫瘤的預(yù)后判斷，但迄今為止尚未見此兩種腫瘤標(biāo)志物與膀胱尿路上皮癌預(yù)后相關(guān)性的臨床研究[2]。因此本研究探討膀胱組織中兩者的表達(dá)水平是否可判斷膀胱尿路上皮癌患者的預(yù)后，進(jìn)一步驗(yàn)證兩種腫瘤標(biāo)志物與膀胱尿路上皮癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月—2013年10月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院就診的74例膀胱尿路上皮癌患者的腫瘤組織作為研究組，其病理分級(jí)依據(jù)1998年世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)劃分：低分化(0～Ⅰ級(jí))53例，中高分化(Ⅱ～Ⅲ級(jí))21例；腫瘤直徑4.6～8.9 cm，平均腫瘤直徑(6.3±2.3)cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽性49例，陰性25例；臨床病理分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期(UICC-TNM)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期6例，Ⅱ期32例，Ⅲ期36例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)膀胱尿路上皮癌診斷符合AJCC2002年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)經(jīng)病理確診，且排除原位癌；(3)術(shù)前未接受放化療、膀胱灌注等治療措施；(4)術(shù)后能按要求定期隨訪1.5年，且臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性支氣管炎及慢性阻塞性肺疾病；(2)合并急性腦卒中；(3)合并不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死等心臟急癥；(4)合并有嚴(yán)重肝腎功能不全。另選取同期在本院行膀胱切開取石術(shù)或開放前列腺切除術(shù)患者23例的膀胱黏膜作為對(duì)照組，其術(shù)前臨床明確診斷為膀胱內(nèi)結(jié)石或前列腺增生，術(shù)后病理證實(shí)；排除嚴(yán)重心、肺、肝、腎等重要器官功能衰竭。兩組患者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及高血壓、2型糖尿病、高脂血癥患病率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)?；颊呔炇鹬橥鈺?。

表1 兩組患者一般資料比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù);a為t值

1.2 免疫組化SP法測(cè)定 兩組所獲得的組織經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋并切片，脫蠟水化后再修復(fù)抗原，采用免疫組化SP法行免疫組織化學(xué)染色。應(yīng)用3%過氧化氫室溫孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。應(yīng)用5%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，滴加1∶100一抗多克隆抗體(兔抗KLF8抗體或者兔抗HMGA2抗體)，4 ℃過夜。PBS沖洗兩次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min；PBS漂洗后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育20 min；PBS漂洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，沖洗后蘇木精-伊紅(HE)染色法復(fù)染。陰性對(duì)照為PBS代替一抗。

在×400倍視野中隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽性百分比得分之積進(jìn)行判定，細(xì)胞染色強(qiáng)度為：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色；KLF8及HMGA2在胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比(0～100%)。將上述2項(xiàng)相乘，弱陽性(±)為<50%，中等陽性(++)為50%～100%，強(qiáng)陽性(+++)為100%～300%。弱陽性定義為低表達(dá)，中等陽性和強(qiáng)陽性定義為高表達(dá)。結(jié)果觀察由病理醫(yī)生在不了解患者臨床資料的情況下獨(dú)立進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組KLF8和HMGA2表達(dá)水平 對(duì)照組KLF8和HMGA2表達(dá)水平分別為(42.1±3.7)%、(2.6±1.3)%；研究組分別為(254.7±23.5)%、(139.6±12.9)%。研究組KLF8和HMGA2表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.872，P=0.002；t=4.593，P=0.001)。

2.2 Spearman相關(guān)分析 膀胱尿路上皮癌患者臨床分期與KLF8和HMGA2表達(dá)水平均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.489、0.561，P<0.05)。

2.3 生存率 患者均隨訪至2015年4月，隨訪時(shí)間為18～24個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為(18.4±6.5)個(gè)月。67例患者在隨訪截止時(shí)存活，累積生存率為90.5%(見圖1)。

圖1 膀胱尿路上皮癌患者生存曲線

2.4 Cox回歸分析 將性別、年齡、吸煙、腫瘤體積、臨床病理分期、KLF8和HMGA2表達(dá)水平納入Cox回歸分析，結(jié)果顯示，臨床病理分期、KLF8和HMGA2表達(dá)水平為膀胱尿路上皮癌患者生存預(yù)后的影響因素(P<0.05，見表2)。

表2 膀胱尿路上皮癌患者生存預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

Table 2 Cox regression analysis on influencing factors for the survival rate of patients with bladder urothelial carcinoma

因素βSEWaldχ2值RR(95%CI)P值性別-0.0720.0712.3410.931(0.794,1.103)0.101年齡0.0040.0672.9841.004(0.843,1.217)0.076吸煙0.0560.0604.9031.058(0.912,1.135)0.062腫瘤體積-0.0880.0933.4380.916(0.826,1.012)0.054臨床病理分期1.1520.1145.0373.165(3.216,6.890)0.043KLF8表達(dá)水平1.8780.2467.7526.543(4.484,9.083)0.013HMGA2表達(dá)水平1.7510.1568.1265.762(5.129,11.217)0.021

注：KLF8=Krüppel樣因子8，HMGA2=高遷移率族蛋白A2

3 討論

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展，膀胱癌發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)，已成為最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中膀胱尿路上皮癌最為常見，其5年生存率大于90%，預(yù)后較好，目前臨床治療的主要方法仍是根治性膀胱切除術(shù)，但是臨床實(shí)踐證實(shí)其復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～85%，其中20%可進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性腫瘤，導(dǎo)致預(yù)后不佳[1]。目前臨床在預(yù)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)、進(jìn)展及預(yù)后等生物學(xué)行為方面主要依靠病理分級(jí)和分期，但其缺乏較好的特異度及靈敏度，因此尋找適宜的生物學(xué)指標(biāo)評(píng)估膀胱尿路上皮癌形成、進(jìn)展以及預(yù)后情況，為臨床治療方案的選擇提供合理的循證證據(jù)，也是目前臨床研究的熱點(diǎn)問題之一。

目前已有許多基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)有許多腫瘤標(biāo)志物與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)，如：E-cadherin、BCA7、RBM3以及FHIT蛋白等，但目前尚未發(fā)現(xiàn)這些分子標(biāo)志物可以直接用于臨床膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)，推測(cè)可能與這些分子標(biāo)志物在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的分子機(jī)制相關(guān)程度欠佳有關(guān)[3]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，KLF8蛋白及HMGA2蛋白在多個(gè)腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，對(duì)于腫瘤患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值也較高[4]。其中KLF8是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，廣泛參與細(xì)胞進(jìn)程，在增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用，能夠調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中起到重要作用[5]。已有研究證實(shí)卵巢上皮癌、乳腺肌上皮癌及腎上皮癌等均為KLF8高表達(dá)水平，而有研究發(fā)現(xiàn)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中KLF8表達(dá)明顯高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，因此認(rèn)為KLF8在膀胱癌的進(jìn)展中具有一定作用[6]。而HMGA基因是一種原癌基因，當(dāng)過度表達(dá)時(shí)會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。已有研究證實(shí)乳腺癌、甲狀腺癌、口腔鱗癌等多種惡性腫瘤中，HMGA濃度的升高與腫瘤的惡性程度升高是一致的，也與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[8]。有基礎(chǔ)研究證實(shí)HMGA2能通過EMT將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)其浸潤(rùn)、遷徙和增生的能力，導(dǎo)致腫瘤的浸潤(rùn)能力增加[9]。但是目前這兩者與膀胱尿路上皮癌患者的預(yù)后是否相關(guān)尚未見報(bào)道，因此本研究對(duì)此進(jìn)行了分析，以了解這兩種生物標(biāo)志物是否能有效評(píng)估膀胱尿路上皮癌患者的預(yù)后結(jié)局，為今后的分子靶向治療提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌患者癌組織KLF8和HMGA2表達(dá)水平顯著高于非膀胱癌人群的膀胱組織，表明膀胱尿路上皮癌患者病灶的KLF8和HMGA2基因是過度表達(dá)的。通過Spearman相關(guān)分析證實(shí)，膀胱尿路上皮癌患者的病理分期與組織KLF8和HMGA2表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示KLF8和HMGA2基因表達(dá)水平越高，導(dǎo)致膀胱尿路上皮癌患者的臨床病情越嚴(yán)重。通過Cox回歸分析，表明癌組織KLF8和HMGA2高水平表達(dá)是膀胱尿路上皮癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此癌組織KLF8和HMGA2表達(dá)水平能較好地反映膀胱尿路上皮癌患者的預(yù)后結(jié)局，KLF8和HMGA2有望為判斷膀胱尿路上皮癌預(yù)后提供新的分子生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)還可為膀胱尿路上皮癌的靶向治療提供特異性靶點(diǎn)。然而KLF8和HMGA2導(dǎo)致膀胱尿路上皮癌形成及發(fā)展的分子機(jī)制目前仍不明確，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也未確定，因此下一步研究方向?qū)⒗^續(xù)對(duì)此進(jìn)行探討。由于本研究納入病例較少，隨訪時(shí)間也較短，因此研究結(jié)果仍需多中心、長(zhǎng)期的臨床試驗(yàn)證實(shí)。

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(本文編輯：賈萌萌)

Expression Levels of KLF8 and HMGA2 Protein in Tissues of Bladder Urothelial Carcinoma and Their Correlation With Prognosis

XINGDong-liang，SONGDong-kui，KANGZheng-jun，etal.

DepartmentofUrologySurgery，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

Objective To investigate the correlation between the expression levels of KLF8 and HMGA2 protein and the prognosis of patients with bladder urothelial carcinoma.Methods We obtained tissues of carcinoma niduses from 74 patients with bladder urothelial carcinoma who received treatment in the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2012 to October 2013 as research group，and we collected the bladder mucous membranes from 23 patients who underwent cystolithotomy or open prostatectomy in the same hospital in the same period as the control group.Immunohistochemical method was employed to examine the expression levels of KLF8 and HMGA2 protein of the two groups.Cox regression analysis was undertaken to investigate the relation between the expression levels of KLF8 and HMGA2 protein and survival prognosis.Results Research group was higher than control group in the expression level of KLF8 and HMGA2(t=3.872，P=0.002；t=4.593，P=0.001).There was positive correlation between clinical staging of patients with bladder urothelial carcinoma and the expression levels of KLF8 and HMGA2(rs=0.489，0.561；P<0.05).The follow-up visits were finished in April 2015，where the number of surviving patients was 67 with a total survival rate of 90.5%.The Cox multivariate regression analysis showed that clinical pathological staging and the expression levels of KLF8 and HMGA2 were influencing factors for the survival prognosis of patients with bladder urothelial carcinoma(P<0.05).Conclusion The high expression levels of KLF8 and HMGA2 protein are risk factors for the survival prognosis of patients with bladder urothelial carcinoma.

Urinary bladder neoplasms；Krüppel-like factor；High mobility group proteins；Prognosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272823)——尿液修飾核苷作為膀胱腫瘤標(biāo)志物的篩選鑒定及分子機(jī)制研究

450052河南省鄭州市，鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科(邢東亮，康鄭軍，酒濤)；鄭州大學(xué)一附院泌尿外科(宋東奎)

宋東奎，450052河南省鄭州市，鄭州大學(xué)一附院泌尿外科；E-mail：dksong@zzu.edu.cn

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.015

2015-02-03；

2015-07-30)