王文藝，丁 巍，楊曉紅

?

·論著·

白介素8蛋白表達水平及基因多態(tài)性與維吾爾族飼鴿者肺的相關性

王文藝，丁 巍，楊曉紅

目的 探討血清及肺泡灌洗液(BALF)中白介素8(IL-8)蛋白表達水平，及血清中單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族飼鴿者肺(PBL)遺傳易患性的相關性。方法 選取2012—2013年在新疆喀什地區(qū)有鴿子接觸史，且血清學抗體陽性，符合PBL診斷標準的維吾爾族患者32例(病例組)；選取有鴿子接觸史，但血清學抗體陰性者30例(陰性對照組)；選取無鴿子接觸史且健康維吾爾族者30例(正常對照組)。采用ELISA分別檢測3組受試者血清及BALF中IL-8蛋白表達水平；通過UCSC數(shù)據(jù)庫選取IL-8的15個基因位點，采用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術對所有位點進行基因分型，比較3組IL-8基因型分布。結果 3組血清、BALF中IL-8蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰性對照組和病例組血清、BALF中IL-8蛋白表達水平均高于正常對照組，病例組血清中IL-8蛋白表達水平高于陰性對照組(P<0.05)。選取的15個基因位點的IL-8基因型分布在3組間不存在基因多態(tài)性。結論 血清、BALF中IL-8蛋白表達水平的增高可能是肺損傷及肺纖維化的誘因，其基因多態(tài)性不增加維吾爾族PBL的發(fā)病風險。

養(yǎng)鳥者肺；肺泡炎，外源性變應性；白細胞介素8；多態(tài)性，單核苷酸

王文藝，丁巍，楊曉紅.白介素8蛋白表達水平及基因多態(tài)性與維吾爾族飼鴿者肺的相關性[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(26)：3173-3176.[www.chinagp.net]

Wang WY，Ding W，Yang XH.Correlation between cytokines IL-8 expression，its gene polymorphism and pigeon breeder′s lung in Uygurs[J].Chinese General Practice，2015，18(26)：3173-3176.

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012—2013年在新疆喀什地區(qū)有鴿子接觸史，且血清學抗體陽性，符合Lacasse等[5]提出的HP診斷標準的維吾爾族患者32例(病例組)，其中男23例，女9例；平均年齡(53.3±12.4)歲；平均接觸鴿子(19.5±11.3)年。選取有鴿子接觸史，但血清學抗體陰性者30例(陰性對照組)，其中男27例，女3例；平均年齡(53.3±14.2)歲；平均接觸鴿子(21.6±14.3)年。病例組與陰性對照組均無自身免疫系統(tǒng)疾病、膠原病、糖尿病及其他肺部疾病。另選取同期無鴿子接觸史且健康維吾爾族人群30例(正常對照組)，其中男16例，女14例；平均年齡(53.1±11.0)歲。3組之間性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=4.796，P=0.091；F=0.005，P=0.364)。受試者均簽署知情同意書。

1.2 資料收集 受試者均接受問卷調查，內容包括：個人一般情況(性別、年齡、種族、吸煙史)、鴿子接觸史(接觸時間、飼養(yǎng)種類、數(shù)量)、PBL診斷史、既往病史和家族史。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA制備 所有入選者于清晨空腹抽取靜脈血4 ml，以3.2%枸櫞酸鈉抗凝，以3 000 r/min離心5 min，留取上清液置于-80 ℃冰箱內儲存?zhèn)溆?。按照全血基因組DNA試劑盒說明書提取DNA，采用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質檢，基因組DNA電泳條帶通常不小于20 kb，將質檢合格的DNA濃度調整到50 mg/L，轉移至384孔板，-20 ℃儲存?zhèn)溆?見圖1)。

圖1 DNA提取圖

1.3.2 ELISA法檢測細胞因子表達水平 入選者均行氣管鏡檢查，留取肺泡灌洗液(BALF)150 ml，采用單層紗布過濾，除去黏液，將濾液在4 ℃條件下，以1 200 r/min離心10 min后，分離上清液裝入硅塑瓶，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測受試者血清、BALF中IL-8蛋白表達水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，在96孔的平板中加入100 μl稀釋的包被抗體，4 ℃孵育過夜，經(jīng)清洗、封閉后，在各孔中加入100 μl稀釋液〔0.1%牛血清清蛋白(BSA)100 mg加入100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中〕，在室溫下孵育60 min，每孔加入100 μl稀釋的生物素化的小鼠抗細胞因子抗體，在室溫下孵育60 min后，再加入100 μl按照1∶1 000稀釋的結合辣根過氧化物酶的親和素稀釋液，在室溫下孵育30 min，最后在每個孔中加入100 μl底物溶液，黑暗中室溫孵育30 min，再加入12.5% H2SO4終止反應，將標準品的測試結果繪制成標準曲線，在分光光度計490 nm波長下讀取光密度值，重復測量3次，根據(jù)測定結果計算細胞因子的表達水平。

1.3.3 設計引物 在UCSC數(shù)據(jù)中通過盲篩的方法選取IL-8的15個位于啟動區(qū)的基因位點，采用Sequenom MassARRAY Assay Design(美國Sequenom公司)進行引物設計，北京博奧生物有限公司負責引物合成(見表1)。

表1 IL-8基因SNP位點的PCR引物及單堿基延伸引物序列

Table 1 PCR primers and single base extension primer sequences of IL-8 gene SNP locus

SNP位點PCR引物序列(5'-3')單堿基延伸引物序列(5'-3')rs139503118正向:ACGTTGGATGCCACTCTCAATCACTCTCAGCATACTCCAAACCTTTCC反向:ACGTTGGATGGCCAAGGAGTGCTAAAGAACrs142957504正向:ACGTTGGATGCCACCTTCCTTAATTTTAAGTttACCACACTGCGCCAACA反向:ACGTTGGATGATTGAGAGTGGACCACACTGrs144469788正向:ACGTTGGATGCCACTCTCAATCACTCTCAGGATGTCAGTGCATAAAGACATAC反向:ACGTTGGATGGCCAAGGAGTGCTAAAGAACrs149273289正向:ACGTTGGATGGGAAAGGTTTGGAGTATGTCaaagtAGTGCTAAAGAACTTAGATGT反向:ACGTTGGATGTGCAGTTTTGCCAAGGAGTGrs185040023正向:ACGTTGGATGGGCTGACTTTGGATTATATGaGGTTGTGGAGAAGTTTTTGA反向:ACGTTGGATGTGCAGAGGGTTGTGGAGAAGrs200005090正向:ACGTTGGATGCCTTCTTATTAAACATAGCTCAGAATGAATTTTTTTATGAATTCTCA反向:ACGTTGGATGCACTGATTCTTGGATACCACrs200094083正向:ACGTTGGATGTGTCCTAGAAGCTTGTGTGCtGTGATGATATAAAAAGCCACC反向:ACGTTGGATGAGTTCTCTAGTAGGGTGATGrs200141723正向:ACGTTGGATGAAGAGCCAGGAAGAAACCACCCAGCTTGGAAGTCATG反向:ACGTTGGATGAAATCAGGAAGGCTGCCAAGrs200170390正向:ACGTTGGATGTGGGCCATCAGTTGCAAATCcTATCATCACCCTACTAGAGAACTTA反向:ACGTTGGATGCTCCGGTGGCTTTTTATATrs200662278正向:ACGTTGGATGCTTTGGATTATATGTCTCAGGGGGTTGTGGAGAAGTTTT反向:ACGTTGGATGAAACTGGGTGCAGAGGGTTGrs201217708正向:ACGTTGGATGTTTACACACAGTGAGATGGgAGGACAAGAGCCAGGAAGAAACCAC反向:ACGTTGGATGAGCACACAAGCTTCTAGGACrs202202182正向:ACGTTGGATGAGAGCCAGGAAGAAACCACCaagAGGAAGGCTGCCAAGAGA反向:ACGTTGGATGCTGCAGAAATCAGGAAGGCrs3181685正向:ACGTTGGATGGTATTATTTATTTGAATCTACGCAATATCTAGGAAAATCCTTATATT反向:ACGTTGGATGGTGCAATATCTAGGAAAATCrs373821605正向:ACGTTGGATGATAATTTCTGTGTTGGCGGAGAGTGATTGAGAGTGGA反向:ACGTTGGATGTACTCCAAACCTTTCCACCCrs56002960正向:ACGTTGGATGAAGAGCCAGGAAGAAACCACTACACACAGTGAGATGG反向:ACGTTGGATGAAATCAGGAAGGCTGCCAAG

1.3.4 基因分型分析 利用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術對IL-8的15個位點進行基因分型。步驟如下：(1)擴增目的基因片段：將適量基因組DNA按一定順序分別加至384孔板，再添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下：Taq聚合酶0.1 U，基因組DNA 5 ng，PCR引物各2.5 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L。PCR反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)45次；72 ℃ 3 min；4 ℃保持；(2)SAP反應：添加0.3 U堿性磷酸酶去除剩余的dNTP。條件為：37 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min；4 ℃維持。(3)單堿基延伸：添加5.4 pmol/L的延伸引物，50 Umol/L dNTP/ddNTP混合物，0.5 U Thermosequenase DNA聚合酶，反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s,循環(huán)40次，72 ℃ 3 min。(4)樹脂純化：反應產(chǎn)物平鋪在6 mg樹脂板上，加16 μl水到對應孔內，把干燥后的樹脂倒入到延伸產(chǎn)物板上，封膜，低速垂直旋轉30 min，使樹脂與反應物充分接觸，離心將樹脂沉入孔的底部。(5)芯片點樣及質譜檢測：將純化產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上后上機測定。SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析，檢測結果使用TYPER 4.0軟件(Sequenom)分型，并輸出結果。

2 結果

2.1 血清及BALF中IL-8蛋白表達水平比較 3組血清、BALF中IL-8蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰性對照組和病例組血清、BALF中IL-8蛋白表達水平均高于正常對照組，病例組血清中IL-8蛋白表達水平高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of protein expression level of IL-8 in serum and BALF among the three groups

組別例數(shù)血清BALF正常對照組302.6±1.92.4±1.8陰性對照組3017.4±4.8a18.2±4.4a病例組3230.2±4.1ab27.2±4.6aF值11.8476.690P值0.0050.002

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05；BALF=肺泡灌洗液

2.2 IL-8的位點在不同組中分型結果 3組中IL-8 rs139503118、rs185040023、rs200141723、rs200170390、rs3181685、rs56002960基因位點均只存在AA基因型；rs142957504、rs149273289、rs200005090、rs201217708、rs202202182、rs373821605基因位點均只存在CC基因型；rs144469788、rs200662278基因位點均只存在TT基因型；rs200094083基因位點只存在GG基因型，故表明選取的15個基因位點的基因型分布在3組間不存在基因多態(tài)性。

3 討論

近年來流行病學資料表明，HP是僅次于結節(jié)病和特發(fā)性肺纖維化(IPF)的一種常見肺間質性疾病。一項愛鴿俱樂部人員的調查顯示，鴿子飼養(yǎng)者PBL患病率為8%～30%[6]，沒有明顯的季節(jié)性，在歐洲和美國多發(fā)生于男性，在墨西哥則多發(fā)生于女性，同時筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)維吾爾族PBL男性多于女性，可能與維吾爾族有飼養(yǎng)鴿子的習慣有關，盡管暴露于飼養(yǎng)鴿子環(huán)境的人數(shù)較多，但僅有5%～15%個體發(fā)病，說明與外源性抗原及自身遺傳易患性相互作用有關[7]。PBL的病因及發(fā)病機制較為復雜，尚未完全明確。

EAA是由于反復吸入分散抗原或對分散抗原敏感而引起，臨床表現(xiàn)為淋巴細胞/巨噬細胞激活形成的肺炎以及表皮細胞形成肉芽腫[8]。IL-8是CXC亞家族趨化性細胞因子的一種，含有4個半胱氨酸殘基，并形成特征性的鏈內二硫鍵，對中性粒細胞具有強趨化作用并可使之激活進入肺泡，中性粒細胞在肺泡中的積累以及介導的損傷均會引起亞家族功能的異常和纖維化[9]。有研究表明，COPD患者的痰液、BALF中炎性細胞總數(shù)及IL-8高表達在COPD氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[10]；本研究結果顯示：長期飼養(yǎng)鴿子者較未飼養(yǎng)鴿子維吾爾族者血清及BALF中IL-8蛋白表達水平較高，BALF中病例組與陰性對照組比較無差異，而血清中病例組高于陰性對照組?？赡芡ㄟ^以下機制高表達：一方面可能通過趨化炎性細胞移向肺組織引起炎性反應，血清IL-8的水平增加與中性粒細胞性肺泡炎的程度有關，其表達水平的增高，可能是肺損傷和纖維化的誘因；另一方面研究發(fā)現(xiàn)血管生成(從已經(jīng)存在的血管上生長出新的血管)是生理性和病理性組織損傷應答中的基本環(huán)節(jié)之一，IL-8是促進血管生成的趨化因子，根據(jù)環(huán)境的不同對機體產(chǎn)生有利或有害的效應，IL-8促進血管生成的作用影響了肺纖維化的進展[11]。最新研究亦發(fā)現(xiàn)，EAA患者血清、BALF中IL-8蛋白表達水平明顯升高[12]，與本研究結果一致。

Hull等[13]提出IL-8基因啟動子區(qū)域的某些位點的單核苷酸多態(tài)性與IL-8基因轉錄活性及血清IL-8蛋白表達水平有關，細胞因子蛋白表達水平與其基因多態(tài)性有關，不同的基因型有可能產(chǎn)生不同的蛋白或者改變其轉錄率，從而影響疾病的易感性及其嚴重性[14]。本研究數(shù)據(jù)證明了IL-8蛋白表達水平在飼養(yǎng)鴿子人群中會增高，本研究通過盲篩的方法選取位于啟動區(qū)的15個基因位點進行基因多態(tài)性的分析，進一步探討IL-8基因型分布在同種族人群中有無統(tǒng)計學差異。而結果顯示：所選取的15個基因位點均不存在基因多態(tài)性。由此可以推斷：IL-8蛋白表達可能在PBL的肺損害及肺纖維化形成中起作用，而其基因多態(tài)性不增加PBL的遺傳風險。從遺傳學的角度來看，查找與疾病發(fā)生相關的基因，主要通過SNP數(shù)據(jù)庫入手查找基因位點進行多態(tài)性的分析，該方法雖簡單易行，但可能得到陰性結果，存在一定的風險性。而本研究所納入病例組的人群并未明確分急性期、亞急性期及慢性期，在UCSC數(shù)據(jù)中通過盲篩選擇突變位點進行基因分型，存在一定的盲目性，且分析時僅在小樣本中行初步嘗試，尚需進一步加大樣本量及增加基因位點進行重復研究來證實和闡明PBL的遺傳學機制，為基因診斷、治療提供新思路。

[1]Barrera L，Mendoza F，Zuiga J，et al.Functional diversity of T-cell subpopulations in subacute and chronic hypersensitivity pneumonitis[J].Am J Respir Crit Care Med，2008，177(1)：44-55.

[2]Selman M.Hypersensitivity pneumonitis：a multifaceted deceiving disorder[J].Clin Chest Med，2004，25(3)：531-547.

[3]Liu HC，Lu MC，Lin YC，et al.Differences in IL-8 in serum and exhaled breath condensate from patients with exacerbated COPD or asthma attacks[J].J Formos Med Assoc，2014，113(12)：908-914.

[4]胡娟，成建華.過敏性肺炎：飼鴿者肺的病因、臨床特征與發(fā)病機制[J].中國免疫學雜志，2004，20(10)：723-726.

[5]Lacasse Y，Assayag E，Cormier Y.Myths and controversies in hypersensitivity pneumonitis[J].Semin Respir Crit Care Med，2008，29(6)：631-642.

[6]Koschel DS，Cardoso C，Wiedemann B，et al.Pulmonary hypertension in chronic hypersensitivity pneumonitis[J].Lung，2012，190(3)：295-302.

[7]Ukichi K，Okamura T，F(xiàn)ukushima D，et al.Th1/Th2 balance in mouse delayed-type hypersensitivity model with mercuric chloride via skin and oral mucosa[J].Bull Tokyo Dent Coll，2011，52(1)：13-20.

[8]Kottmann R，Phipps R，Sime P.Reply：from idiopathic pulmonary fibrosis to cystic fibrosis：got lactate[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，188(1)：111-112.

[9]Nance S，Cross R，F(xiàn)itzpatrick E.Chemokine production during hypersensitivity pneumonitis[J].Eur J Immunol，2004，34(3)：677-685.

[10]Bozinovski S，Anthony D，Vlahos R.Targeting pro-resolution pathways to combat chronic inflammation in COPD[J].J Thorac Dis，2014，6(11)：1548-1556.

[11]Takeuchi M，Oh-I K，Suzuki J，et al.Elevated serum levels of CXCL9/monokine induced by interferon-gamma and CXCLl0/interferon-gamma-inducible protein-10 in ocular sarcoidosis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(3)：1063-1068.

[12]Peljto AL，Zhang Y，F(xiàn)ingerlin TE，et al.Association between the MUC5B promoter polymorphism and survival in patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J].JAMA，2013，309(21)：2232-2239.

[13]Hull J，Ackerman H，Isles K，et al.Unusal haplotypic structure of IL8，a susceptibility locus for a common respiratory virus[J].Am J Hum Genet，2001，69(2)：413-419.

[14]Larsen MH，Albrechtsen A，Th?rner LW，et al.Genome-wide association study of genetic variants in LPS-Stimulated IL-6，IL-8，IL-10，IL-1ra and TNF-α Cytokine response in a Danish Cohort[J].PLoS One，2013，8(6)：e66262.

(本文編輯：賈萌萌)

Correlation Between Cytokines IL-8 Expression，Its Gene Polymorphism and Pigeon Breeder′s Lung in Uygurs

WANGWen-yi，DINGWei，YANGXiao-hong.

DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，People′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830000，China

Objective To investigate the correlation between the protein expression level of IL-8 in serum and BALF，single nucleotide polymorphism in serum and the genetic susceptibility to pigeon breeder′s lung(PBL) in Uygurs.Methods From 2012 to 2013，we enrolled 32 subjects Uygurs who had contact with pigeons，had positive serologic antibody and accorded with diagnostic criteria as case group；we enrolled 30 people who had contact with pigeons and were with negative serological antibody as negative control group；we selected 30 healthy uygurs who had no contact with pigeon as normal control group.The subjects were all selected from Kashi Prefecture.ELISA was used to detect the protein expression level of IL-8 in serum and BALF of the subjects.Through UCSC database，we selected 15 genetic loci of IL-8.Sequenom MassARRAY?SNP typing technology was employed to conduct genetic typing.Comparison was made among the three groups in the genotype distribution of IL-8.Results The three groups were significantly different(P<0.05)in the protein expression level of IL-8 in serum and BALF；the negative control group and the case group were higher(P<0.05)than the normal control group in the protein expression level of IL-8 in serum and BALF，and the case group was higher(P<0.05)than the negative control group in the protein expression level of IL-8 in serum.No gene polymorphism was found in the 15 gene loci of IL-8 of the three groups.Conclusion The increase of protein expression level of IL-8 in serum and BALF may be an incentive to cause lung injury and fibrosis，but gene polymorphism does not increase the risk of PBL in Uygurs.

Bird fancier′s lung;Alveolitis，extrinsic allergic；Interleukin-8；Polymorphisms，single nucleotide

國家自然科學基金資助項目(81260003)

830000新疆烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

楊曉紅，830000新疆烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科；E-mail：yxh6176@126.com

R 563.19

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.012

2015-01-06；

2015-06-06)