張海峰 馬愛玲 王漪檬 修 佳 趙紅衛(wèi) 秦玉花 趙寧民

河南省人民醫(yī)院藥學部，河南鄭州 450003

依托咪酯是目前最常用的靜脈全麻藥，由于該藥具有代謝快、蓄積少、蘇醒快等優(yōu)點而被廣泛用于麻醉誘導與維持[1]。本研究擬建立人血漿中依托咪酯的檢測方法學并驗證方法學的可靠性。

1 資料與方法

1.1 儀器

Waters 1525 高效液相色譜儀，Waters 2489 紫外檢測器，AUW120D 電子天平（日本島津），WH-866 旋渦混合器，TL-420D 型電控多用恒溫水箱，上海800 型離心沉淀器。

1.2 試藥

依托咪酯對照品（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20121001，含量：99.9%）；甲醇為色譜純；二氯甲烷為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（75 ∶25），流速：1.0mL/min；檢測波長：241nm；柱溫：室溫；進樣量：20μL。

2.2 標準溶液的制備

準確稱取依托咪酯對照品5.0mg，置100mL 量瓶，用甲醇溶解并定容，制備成濃度為50μg/mL 的依托咪酯對照品貯備液。依次量取50μg/mL 的依托咪酯對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成2.5、5、10、20、40、50μg/mL 的標準系列溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取空白血漿500μL 于10mL 具塞試管中，準確加入500μL 依托咪酯標準溶液，混合后，加入5mL二氯甲烷，漩渦混勻1min，3000r/min 離心5 min，取下層液4mL 于5mL 尖底試管中，在40℃水浴中用輕柔空氣吹干，用200μL 甲醇溶解，3000r/min 離心5min，取20μL 上清進樣分析。

2.4 專屬性試驗

取空白血漿500μL，按“2.3”項下方法處理并進樣檢測作為空白溶液色譜圖；平行取空白血漿500μL，加入依托咪酯標準溶液，按“2.3”項下方法處理并進樣檢測作為空白血漿加對照品色譜圖；取手術病人依托咪酯0.6mg/kg 靜脈點滴給藥10min后動脈血，置于EDTA 抗凝管中，血漿樣品按“2.3”項下方法處理并檢測作為患者血漿樣品色譜圖，記錄色譜圖見圖1。依托咪酯保留時間約5.5min，色譜峰峰形良好，血漿內(nèi)源性物質不干擾樣品測定，本方法具有較高的專屬性。

圖1 人血漿中依托咪酯HPLC 色譜圖

2.5 線性關系考察

取空白血漿500μL 于10mL 具塞試管中，分別加 入50μL 濃 度 為2.5、5、10、20、40、50μg/mL 的 標準系列溶液，配置成濃度為0.25μg/mL、0.5、1.01、2.0、4.0、5.0μg/mL 的依托咪酯血漿對照品，按“2.3”項下方法處理，取20μL 進樣分析。以依托咪酯的血漿濃度作為橫坐標，依托咪酯的峰面積作為縱坐標，峰面積y 對濃度x 作線性回歸，線性方程為y=39285x-5124.6，r=0.9987，線性范圍為0.25 ～5.0μg/mL。

2.6 精密度試驗

取空白血漿500μL，分別加入依托咪酯標準系列溶液，配置成濃度為0.5、1.0、4.0μg/mL 的血漿對照品，按“2.3”項下方法處理，取20μL 進樣分析。每個濃度連續(xù)進樣5 次，計算RSD 作為日內(nèi)精密度；5 天內(nèi)每天測定1 次，計算RSD 作為日間精密度，結果見表1。

2.7 回收率試驗

取空白血漿500μL，分別加入依托咪酯標準系列溶液，配置成濃度為0.5、1.0、4.0 μg/mL 的血漿對照品，每個濃度平行制備3 份，按“2.3”項下方法處理，取20μL 進樣分析。用回歸方程計算檢出量，并與加入量比較，計算方法回收率，結果見表2。

表1 人血漿中依托咪酯精密度結果（n=5）

將空白血漿500μL 換成流動相，同法配制上述3 種濃度的依托咪酯溶液，每個濃度平行制備3份，按“2.3”項下方法處理，取20μL 進樣分析。將同濃度血漿樣品和流動相制備的樣品峰面積進行比較，計算提取回收率，結果見表2。

表2 人血漿中依托咪酯回收率結果（n=3）

2.8 穩(wěn)定性試驗

取空白血漿500μL，分別加入依托咪酯標準系列溶液，配置成濃度為0.5、1.0、4.0μg/mL 的血漿對照品，每個濃度平行制備3 份，放置于-30℃低溫冰箱保存，分別于第7 天、15 天、30 天取出血漿對照品，按“2.3”項下方法處理，取20μL 進樣分析。結果各濃度的RSD 均小于4.1%，表明血漿中依托咪酯-30℃低溫冰箱保存30d 穩(wěn)定性好。

3 討論

依托咪酯制劑中依托咪酯的含量測定方法，國內(nèi)已有多篇文獻報道[2-6]，但存在檢測速度慢、操作復雜等缺點。血漿中藥物濃度的檢測方法和制劑中藥物濃度的檢測方法有較大不同，本研究擬建立人血漿中依托咪酯的檢測方法學。

文獻檢索發(fā)現(xiàn)：血漿中依托咪酯的含量測定方法國外已有多篇文獻報道[7-11]，國內(nèi)僅有一篇文獻報道[12]。本實驗建立的高效液相色譜法采用甲醇-水（75 ∶25）為流動相，流動相配置簡單，樣品出峰快，出峰時間大約在5.5min，該方法簡便、快捷、準確、可靠，更適用于人血漿中依托咪酯濃度的測定。

本研究預實驗采用了沉淀蛋白法進行血漿樣品預處理，分別采用400μL 甲醇、乙腈等有機溶劑沉淀蛋白后，取上清進樣。但是檢測靈敏度達不到臨床要求。在上述方法的基礎上，沉淀蛋白后取上清500μL，空氣吹干，用100μL 甲醇復溶濃縮后進樣，但是靈敏度還是不夠，因此沉淀蛋白法不適用本研究。正式試驗改用了液液萃取法，取得了良好的效果。由于依托咪酯極易溶于三氯甲烷，所以本試驗選擇了毒性較小的二氯甲烷作為萃取溶劑，結果表明，提取回收率與靈敏度均符合要求。

本試驗在前期研究基礎[3]上優(yōu)化了色譜條件是，采用甲醇-水為流動相，優(yōu)化其比例為75：25，室溫條件下，檢測波長為241nm，流速為1.0mL/min，依托咪酯在5.5min 出峰。血漿內(nèi)源性物質不干擾樣品測定，具有較好的專屬性。改進后建立的HPLC 法簡便準確，專屬性及重現(xiàn)性良好，可用于藥代動力學研究。

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